Nogo-66受体作为阿尔茨海默病药物治疗新靶标的研究

发布时间：2020-11-17 06:59

　　 目的 研究Nogo-66受体(Nogo-66 receptor, NgR)能否作为药物治疗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的潜在靶标。此靶标是否具备促进皮质神经元突起再生和抑制β淀粉样蛋白(amyloid P-protein, Aβ)生成的双重作用。同时寻找具备促进皮质神经元突起再生和抑制Aβ生成双重作用的AD治疗药物。方法 (1)体外无血清培养新生大鼠皮质神经元,采用神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase, NSE)和微管相关蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP2)免疫化学染色法进行神经元鉴定；(2)采用不同细胞密度和不同浓度的B27培养大鼠皮质神经元,观察其对皮质神经元生长的影响；(3)体外培养大鼠皮质神经元,加入不同浓度的Nogo-66活性片段——Nogo-P4,用MTT法检测不同浓度的Nogo-P4 (3.5μM、7μM、14μM)对皮质神经元的毒性作用,通过细胞形态学观察,突起生长状况的定量分析,观察Nogo-P4对皮质神经元突起生长的影响,应用ELISA (enzyme-linked immunoadsordent assay)法测定细胞分泌的Aβ42含量,观察Nogo-P4对皮质神经元Aβ42分泌的影响；(4)体外培养大鼠皮质神经元,分别加入Nogo-66受体阻断剂NEP1-40、受体下游信号分子ROCK (rho-associated coiled coil-containing protein kinase)的抑制剂Y-27632和PKC (protein kinase C, PKC)抑制剂GO6976,采用上述指标,研究Nogo-P4影响皮质神经元突起生长和Aβ42分泌的机制；(5)采用Nogo-P4制作细胞模型并进行药物筛选,从中药单体中寻找有效化合物。 结果 (1)经两种不同的神经元特异性标志物(NSE和MAP-2)鉴定,确定所培养的细胞绝大多数为神经元；(2)合适的细胞密度(1200个／mm2)和合适的B27浓度(2%B27)有利于皮质神经元的生长,神经突起生长较长；(3)不同浓度的Nogo-P4对皮质神经元的存活率没有影响,不具有细胞毒作用。不同浓度的Nogo-P4能减少有突起细胞数量,明显降低神经元的平均突起长度,抑制皮质神经元突起的再生,同时还能增加培养基中的Aβ42含量,促进皮质神经元分泌Aβ42,并具有量效关系；(4)Nogo-66受体拮抗剂NEP1-40、PKC抑制剂GO6976和ROCK抑制剂Y-27632对正常皮质神经元的突起生长和Aβ42的分泌无影响,对Nogo-P4引起的皮质神经元突起再生抑制均有拮抗作用,能增加有突起细胞数量和神经元平均突起长度,对Nogo-P4引起的Aβ42生成有不同的影响。NEP1-40能促进皮质神经元突起再生,但不能减少Aβ42的生成。GO6976能促进皮质神经元突起再生,同时增加Aβ42的生成。Y-27632不仅能促进皮质神经元突起再生,同时也能减少Aβ42的生成；(5)经过药物筛选,找到一个有效单体SQ,能拮抗Nogo-P4增加有突起细胞数量和神经元平均突起长度,促进神经元突起的再生。但SQ不能减少皮质神经元分泌Aβ42。结论 (1) Nogo-P4能抑制大鼠皮质神经元的突起再生,同时促进大鼠皮质神经元分泌Aβ42; (2)Nogo-P4抑制皮质神经元突起再生是通过Nogo-66受体及下游信号分子ROCK和PKC的激活所引起。其促进Aβ42的分泌与其受体下游信号分子ROCK的激活有关；(3) Nogo-66受体可以作为促进皮质神经元突起再生的靶标,不能作为抑制Aβ42生成的靶标,可以作为AD治疗的靶标,但不是最佳靶标。PKC可以作为促进皮质神经元突起再生的靶标,同时又是促进Aβ42生成的靶标,综合考虑,PKC不宜作为AD治疗的靶标。ROCK可以作为促进皮质神经元突起再生和抑制Aβ42生成双重作用的靶标,是药物治疗AD的一个理想靶标,针对此靶标的AD治疗药物将更加有效；(4)中药单体SQ能促进皮质神经元突起再生,但不能抑制Aβ42的生成,其可能的作用靶标是Nogo-66受体。
【学位单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R749.16
【部分图文】：

多聚赖氨酸的96孔培养板，培养6小时细胞贴壁后，更换新鲜培养基100林L，此时加入不同浓度的药物，并设置溶媒对照组。继续培养皮质神经元，药物作用48小时后，每孔加入smgmL一，MTT15林L，继续培养4小时后吸弃上清，加入150林L二甲基亚枫(DMSO)，在微孔板振荡器上振荡lomin直至晶体完全溶解。将96孔培养板置于酶标仪上，在57伪Lm波长下测各孔吸光度值，定量反映细胞的存活率。每组设8个复孔，并计算其平均值。2.5细胞形态学观察和定量分析24孔或96孔板培养皮质神经元，细胞6小时贴壁后，更换新鲜培养基。将不同浓度的药物分别加入各组神经元培养基中，并设置空白对照组，每组设4个复孔，继续培养48小时后，进行形态学观察和定量分析。在倒置相差显微镜下(400x)观察各组细胞的形态及突起生长状况，以胞体呈明显晕光，长出突起的皮质神经元为记录对象，随机选取32个视野进行拍照，记录每组神经元的形态及突起生长状况。

多聚赖氨酸的96孔培养板，培养6小时细胞贴壁后，更换新鲜培养基100林L，此时加入不同浓度的药物，并设置溶媒对照组。继续培养皮质神经元，药物作用48小时后，每孔加入smgmL一，MTT15林L，继续培养4小时后吸弃上清，加入150林L二甲基亚枫(DMSO)，在微孔板振荡器上振荡lomin直至晶体完全溶解。将96孔培养板置于酶标仪上，在57伪Lm波长下测各孔吸光度值，定量反映细胞的存活率。每组设8个复孔，并计算其平均值。2.5细胞形态学观察和定量分析24孔或96孔板培养皮质神经元，细胞6小时贴壁后，更换新鲜培养基。将不同浓度的药物分别加入各组神经元培养基中，并设置空白对照组，每组设4个复孔，继续培养48小时后，进行形态学观察和定量分析。在倒置相差显微镜下(400x)观察各组细胞的形态及突起生长状况，以胞体呈明显晕光，长出突起的皮质神经元为记录对象，随机选取32个视野进行拍照，记录每组神经元的形态及突起生长状况。
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本文编号：2887210