干扰Olig2对MK-801介导的海马神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响

发布时间：2020-11-17 14:14

　　 目的体外培养小鼠海马神经干细胞(NSCs),明确干扰Olig2对MK-801处理后海马NSCs增殖、分化及凋亡的影响,探究Olig2对MK-801干预后海马神经发生的调控作用。方法选取24h以内的新生C57BL/6小鼠,分离提取海马组织用来原代培养NSCs,采用免疫荧光染色进行细胞鉴定和纯度鉴定。用200μM的MK-801处理NSCs 24h以建立细胞损伤模型,并在此基础上进行Olig2-shRNA慢病毒感染,将NSCs分为4组:(1)MK-801+慢病毒干扰组[MK801+Olig2-shRNA组简称(M+O组)],(2)MK-801+慢病毒空载体组[MK-801+LV-EGFP简称(M+L组)],(3)MK-801组(简称M组),(4)空白对照组(简称Blank组)。采用Western blot检测Olig2的表达,以确定Olig2-shRNA慢病毒载体是否构建成功。采用Western blot、Real-time PCR、免疫细胞化学技术检测Nestin、Sox2、Ki67、S100β和NeuN的表达,以观察NSCs的增殖和分化情况,用流式细胞术检测NSCs凋亡情况。结果Western blot结果显示,Olig2-shRNA1组可明显降低Olig2的表达(P0.05);与M组相比较,M+O组中Olig2表达明显降低(P0.05),NeuN、Sox2显著升高(P0.05),M+L组和Blank组中Olig2、NeuN、Sox2的表达均无统计学差异(P0.05)。qRT-PCR结果显示,与M组相比较,M+O组中Nestin和Ki67表达显著升高(P0.05),Blank组Nestin表达量显著升高(P0.05),M+L组与M组相比Nestin表达量无统计学差异(P0.05),M+L组和Blank组分别与M组相比,Ki67的表达均无统计学差异(P0.05),M+O组、M+L组和Blank组S100β均无统计学差异;免疫荧光结果显示,与M组相比,M+O组Ki67表达显著升高(P0.05),M+L组和Blank组Ki67表达无统计学差异(P0.05),M+O组、M+L组和Blank组S100β均无统计学差异;流式细胞技术结果显示,M+O组早期凋亡和总凋亡率较M组的凋亡率均降低且有统计学差异(P0.05),晚期凋亡对比无明显差异;M组较Blank组早期凋亡和总凋亡率升高且有统计学差异(P0.05)。结论1.经MK-801处理NSCs后其增殖能力下降,凋亡增加。2.低表达Olig2可促进精神分裂症后NSCs的增殖、促进NSCs向神经元分化,减少细胞凋亡,增加海马神经发生。
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R749.3
【部分图文】：

1. 小鼠海马 NSCs 培养及鉴定原代培养 24 h 后，在条件培养基培养下 NSCs 呈现悬浮状态，圆形，形态规则且折光性良好并且未见明显聚球情况，可见部分颜色灰暗、折光性差的坏死细胞和细胞碎片会沉入培养瓶底，继续培养 1-2 天，可见有少数细胞聚集成细胞团状，继续培养 2-3 天可见细胞成桑葚状聚集成球，这些克隆细胞球球体边缘整齐，克隆球内细胞未见突起排列紧密，折光性良好，并且随培养时间增加而体积变大。培养至第 6-8 天时，克隆球中间颜色加深表示细胞进入衰老状态进行传代处理。细胞传代后，会继续以单个悬浮细胞聚集成克隆球生长，传代后，细胞贴壁状态会减少，生长状态一般会加快。选取第二代第 3 天使用免疫荧光标记法进行细胞鉴定。Nestin 标记海马 NSCs，Nestin（red）和DAPI（blue）共表达。（图 1）

图 2 NSCs 克隆球消化为单细胞后的 Nestin 免疫荧光染色结果。A 表示 Nestin 标记 NSCs，呈现红色B 表示 DAPI 染细胞核，呈现蓝色，C 表示 Nestin 与 DAPI 共标记代表阳性细胞。Scale bar=50 μm3. Olig2 干扰慢病毒感染时间的确定对海马 NSCs 分别进行 24 h、48 h、72 h 慢病毒感染处理，结果显示：细胞的荧光强度随感染时间的增加而增强，72 h 荧光强度最强。因此，后续实验本实验将海马 NSC的感染时间确定为 72 h。（图 3）

图 2 NSCs 克隆球消化为单细胞后的 Nestin 免疫荧光染色结果。A 表示 Nestin 标记 NSCs，呈现红色B 表示 DAPI 染细胞核，呈现蓝色，C 表示 Nestin 与 DAPI 共标记代表阳性细胞。Scale bar=50 μm3. Olig2 干扰慢病毒感染时间的确定对海马 NSCs 分别进行 24 h、48 h、72 h 慢病毒感染处理，结果显示：细胞的荧光强度随感染时间的增加而增强，72 h 荧光强度最强。因此，后续实验本实验将海马 NS的感染时间确定为 72 h。（图 3）
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本文编号：2887602