目的:阿尔茨海默病(AD)是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变。β淀粉样蛋白(Aβ)清除在AD的发生发展中起到不可忽视的作用,水通道蛋白4(AQP4)的极性分布与Aβ清除密切相关,目前在AD脑中AQP4极性丧失的机制尚不明确。α-互生蛋白(SNTA1)和AQP4两个亚型M1和M23的比例(AQP4-M1/M23)参与调节AQP4的极性分布。Sin3/组蛋白去乙酰化酶(HDAC)复合物可以调控SNTA1的表达,HDAC1和HDAC2是Sin3/HDAC复合物的核心,提示HDAC1和/或HDAC2可能参与SNTA1的调控。此外,microRNA-130a可以在转录水平抑制AQP4-M1的表达,从而下调AQP4-M1/M23,而microRNA-130a又可以被HDAC3抑制,提示HDAC3可能通过调节microRNA-130a的表达参与AQP4-M1/M23的调控。在AD脑中HDAC1、HDAC2和HDAC3表达均升高,组蛋白乙酰化水平明显降低。然而,SNTA1及AQP4-M1/M23在AD脑中是否发生改变尚未见报道。间歇性禁食可以使血中β-羟基丁酸(βOHB)水平升高,βOHB可以透过血脑屏障并且是一种HDACs的泛抑制剂,能够抑制HDAC1、HDAC2和HDAC3表达,上调组蛋白乙酰化水平。因此,本研究采用APPswe/PS1dE9双转基因小鼠以及Aβ诱导的人星形胶质细胞瘤(U251)细胞系为AD模型,旨在探讨AD脑中AQP4极性丧失的机制,以及间歇性禁食能否恢复AD脑中AQP4的极性分布,为AD的防治提供科学依据。研究方法:1、动物分组及处理:选取5月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠及同窝出生的野生型C57/BL6小鼠,分为AD模型组和AD禁食组,野生对照组和野生禁食组。AD禁食组及野生禁食组小鼠采取摄食与禁食各24小时交替进行的干预措施,AD模型组及野生对照组小鼠实验期间自由摄食,连续处理5个月,然后乙醚麻醉后处死。取右半脑固定于4%多聚甲醛液用于免疫荧光实验;取左半脑,剥离皮质,用于qRT-PCR和Western Blotting实验。2、细胞分组及处理:选用人星形胶质瘤细胞(U251),分为对照组、βOHB组、Aβ(2、10μM)组和βOHB+Aβ(2、10μM)组。βOHB组、βOHB+Aβ(2、10μM)组用1 mMβOHB预处理3小时,之后Aβ(2、10μM)组、βOHB+Aβ(2、10μM)组细胞加入终浓度为2或10μM的Aβ,继续培养12小时。3、小鼠大脑皮质AQP4极性分布情况:采用免疫荧光双标实验检测。4、小鼠大脑皮质及U251细胞相关mRNA表达水平分析:采用qRT-PCR方法检测AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1、HDAC1、HDAC2、HDAC3 mRNA及microRNA-130a相对表达水平。5、小鼠大脑皮质及U251细胞相关蛋白检测分析:采用Western Blotting法检测AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1、HDAC1、HDAC2、HDAC3及乙酰化的组蛋白3第9个赖氨酸位点(Ace-H3K9)与Ace-H4K12蛋白相对表达水平。6、沉默HDAC1、HDAC2基因后U251细胞SNTA1mRNA和蛋白水平:采用siRNA干扰法沉默U251细胞的HDAC1或HDAC2基因。分别采用qRT-PCR和Western Blotting法检测细胞中HDAC1、HDAC2、SNTA1mRNA及蛋白相对表达水平。7、microRNA-130a模拟物和抑制剂处理的U251细胞AQP4及其亚型mRNA和蛋白水平:分别采用qRT-PCR和Western Blotting法检测。8、沉默HDAC3基因后U251细胞microRNA-130a表达及AQP4 mRNA和蛋白水平检测:采用siRNA干扰法和HDAC3特异性抑制剂RGFP966干预沉默或抑制细胞的HDAC3基因。采用qRT-PCR法检测microRNA-130a,分别采用qRT-PCR和Western Blotting法检测细胞中AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、HDAC3 mRNA及蛋白相对表达水平。9、统计分析:采用SPSS20.0建立数据库,进行统计分析。结果表示为均数±标准差。各组数值的比较均采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著差值法。P0.05时差异有统计学意义。结果:1、在野生对照组和野生禁食组小鼠大脑皮质中,AQP4高度定位于包绕在大脑微血管周围星形胶质细胞的终足上,呈极性分布。在AD模型组小鼠大脑皮质中,AQP4定位发生紊乱,表现出定位于星形胶质细胞终足上的AQP4减少,在胞体内表达的增加。AD禁食组小鼠大脑皮质中,AQP4的极性有所恢复。2、与野生对照组小鼠比较,AD模型组小鼠大脑皮质AQP4、AQP4-M1 mRNA和蛋白表达水平升高,AQP4-M1/M23升高,SNTA1 mRNA和蛋白表达水平降低(P0.05)。与AD模型组小鼠相比,AD禁食组小鼠大脑皮质AQP4、AQP4-M1 mRNA和蛋白相对表达水平降低,AQP4-M1/M23降低,SNTA1 mRNA和蛋白表达水平升高(P0.01,P0.05)。3、与对照组相比,βOHB组细胞AQP4-M23和SNTA1 mRNA和蛋白表达水平升高,AQP4-M1/M23降低;Aβ(2μM)组细胞AQP4、AQP4-M1 mRNA和蛋白表达水平升高,AQP4-M1/M23比例升高,SNTA1 mRNA和蛋白表达水平降低;Aβ(10μM)组细胞AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表达水平降低,AQP4-M1/M23比例升高(P0.01)。与Aβ(2μM)组相比,Aβ(10μM)组细胞AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表达水平降低,βOHB+Aβ(2μM)组细胞AQP4-M1 mRNA和蛋白表达水平降低,AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表达水平升高,AQP4-M1/M23比例降低(P0.05,P0.01)。与Aβ(10μM)组相比,βOHB+Aβ(10μM)组细胞AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表达水平升高,AQP4-M1/M23比例降低(P0.05,P0.01)。4、与野生对照组小鼠比较,AD模型组小鼠大脑皮质Ace-H3K9和Ace-H4K12表达水平降低,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表达水平升高(P0.01)。与AD模型组小鼠相比,AD禁食组小鼠大脑皮质Ace-H3K9和Ace-H4K12表达水平升高,HDAC1、HDAC2mRNA和蛋白表达水平降低(P0.01)。5、与对照组相比,βOHB组细胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表达水平升高,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表达水平降低;Aβ(2μM)组和Aβ(10μM)组细胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表达水平降低,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表达水平升高(P0.05;P0.01)。与Aβ(2μM)组相比,Aβ(10μM)组细胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表达水平降低,HDAC1、HDAC2mRNA和蛋白表达水平升高;βOHB+Aβ(2μM)组细胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表达水平升高,HDAC1、HDAC2 m RNA和蛋白表达水平降低(P0.01)。与Aβ(10μM)组相比,βOHB+Aβ(10μM)组细胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表达水平升高,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表达水平降低(P0.01)。6、与对照组相比,沉默HDAC1后细胞SNTA1 mRNA和蛋白相对表达水平显著性增加(P0.01)。但是,沉默HDAC2后细胞SNTA1 mRNA和蛋白相对表达水平与对照组相比未见明显改变(P0.05)。7、与野生对照组小鼠比较,AD模型组小鼠大脑皮质miRNA-130a表达水平降低,HDAC3 mRNA和蛋白表达水平升高(P0.05,P0.01)。与AD模型组小鼠相比,AD禁食组小鼠大脑皮质miRNA-130a表达水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表达水平降低(P0.05,P0.01)。8、与对照组相比,βOHB组细胞miRNA-130a表达水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表达水平降低(P0.05);Aβ(2μM)组和Aβ(10μM)组细胞miRNA-130a表达水平降低,HDAC3mRNA和蛋白表达水平升高(P0.05,P0.01)。与Aβ(2μM)组相比,Aβ(10μM)组细胞miRNA-130a表达水平降低,HDAC3 mRNA和蛋白表达水平升高;βOHB+Aβ(2μM)组细胞mi RNA-130a表达水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表达水平降低(P0.05)。与Aβ(10μM)组相比,βOHB+Aβ(10μM)组细胞miRNA-130a表达水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表达水平降低(P0.05,P0.01)。9、与模拟物对照组细胞比较,miRNA-130a模拟物组细胞AQP4-M1 mRNA相对表达水平降低,AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23蛋白相对表达水平降低,AQP4-M1/M23比例下降(P0.05,P0.01)。与抑制剂对照组小鼠相比,miRNA-130a抑制剂组细胞AQP4-M1 mRNA相对表达水平升高,AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23蛋白相对表达水平升高,AQP4-M1/M23比例增加(P0.05,P0.01)。10、与对照组相比,采用siRNA干扰和HDAC3特异性抑制剂沉默HDAC3后细胞miRNA-130a相对表达水平显著性增加,AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23 mRNA和蛋白表达水平升高,AQP4-M1/M23比例降低(P0.01)。结论:1、间歇性禁食可通过抑制APPswe/PS1dE9双转基因AD模型小鼠大脑皮质SNTA1的降低及AQP4-M1/M23的上调恢复AQP4的极性分布,βOHB可能部分介导了该作用。2、βOHB可能通过抑制HDAC1的表达介导间歇性禁食拮抗AD模型小鼠大脑皮质SNTA1表达的降低。3、βOHB对HDAC3的抑制和对miRNA-130a的上调可能是βOHB介导间歇性禁食拮抗AD模型小鼠大脑皮质AQP4-M1/M23上调的潜在机制。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R749.16
【部分图文】：
15图 1 各组小鼠大脑皮质 AQP4 定位情况（n = 10）注：标尺为 100 μm，放大倍数 10×10。红色、绿色荧光分别代表 CD31 及 AQP4；merge（黄色）代表定位在包绕于脑微血管周围的星形胶质细胞的终足上的 AQP4。3.2 隔日禁食对大脑皮质 AQP4 及其各亚型 mRNA 及蛋白表达的影响如图2所示，与野生对照组小鼠比较，AD模型组小鼠大脑皮质AQP4、AQP4-M1mRNA 相对表达水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与 AD 模型组小鼠相比，AD 禁食组小鼠大脑皮质 AQP4、AQP4-M1 mRNA 相对表达水平降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组小鼠大脑皮质 AQP4-M23 mRNA 相对表达水平差异均无统计学意义（P > 0.05）。
色）代表定位在包绕于脑微血管周围的星形胶质细胞的终足上的 AQP4。3.2 隔日禁食对大脑皮质 AQP4 及其各亚型 mRNA 及蛋白表达的影响如图2所示，与野生对照组小鼠比较，AD模型组小鼠大脑皮质AQP4、AQP4-M1mRNA 相对表达水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与 AD 模型组小鼠相比，AD 禁食组小鼠大脑皮质 AQP4、AQP4-M1 mRNA 相对表达水平降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组小鼠大脑皮质 AQP4-M23 mRNA 相对表达水平差异均无统计学意义（P > 0.05）。
图 2 各组小鼠大脑皮质 AQP4 及各亚型 mRNA 相对表达水平（n =生对照组相比，*P < 0.05；与 AD 模型组相比，#P < 0.05。WT，野生对照；AD，AD 模型组；AD+ADF，AD 禁食组。 及各亚型蛋白免疫条带和光密度分析结果见图 3。与野生对模型组小鼠大脑皮质 AQP4、AQP4-M1 蛋白相对表达水M23 比例升高，差异有统计学意义（P < 0.05；P < 0.01）。与AD 禁食组小鼠大脑皮质 AQP4、AQP4-M1 蛋白相对表达M23 比例降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。各组小 蛋白相对表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）。
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本文编号：
2888376
