帕金森病伴轻度认知障碍相关基因GBA调控区SNP鉴定及其功能研究

发布时间：2021-06-15 23:54

　　帕金森病（Parkinson’s disease,PD）现今已经成为仅次于阿尔兹海默症的第二大神经系统退行性疾病。PD的运动症状（运动迟缓、震颤、肌强直和姿势步态异常）为人们所熟知,但其非运动症状常常被忽视;认知障碍是最常见且具有致残性的非运动症状,其中包括PD轻度认知障碍（PD mild cognitive impairment,PD-MCI）和PD痴呆（PD dementia,PDD）,MCI是PD晚期发生痴呆的预警信号之一。研究显示,当诊断为PD时,将近30%患者已患有MCI;超过40%认知功能正常的PD患者将在6年内发展为MCI,而到了PD晚期,将近80%的患者可出现PDD。PDD严重损害患者的身心健康,显著降低其生活质量,给家庭和社会带来沉重的负担。因此,若能及时检测和早发现并进行干预,有利于阻止晚年痴呆的发展。但目前并无早期诊断PD认知障碍的生物标志物,其症状性治疗获益有限,也尚无充分证据表明任何一种药物有确切的疾病修饰疗效、从而延迟PD患者的认知下降。葡萄糖脑苷酯酶（Glucocerebrosidase,GBA）功能丧失突变与PD的严重认知障碍相关,GBA突变的PD患者认... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

GBA调控区的SNPrs12411216鉴定

第3章结果与讨论27图3-2PD患者GBA表达量与rs12411216基因型之间的关系3.4SNPrs12411216突变显著影响GBA基因的表达因为PD是神经系统退行性疾病，所以本实验中使用SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞）。作为实验后续能否成功进行的前提，细胞内目标基因表达的情况是十分关键的。为了鉴定细胞内目标基因表达，本研究先使用了RNA试剂盒提取了SY5Y细胞的RNA。再把提取出的RNA当作模板,通过RT-PCR的方法来合成cDNA。之后设计PCR和琼脂糖凝胶电泳实验，分别把SY5Y细胞的基因组和水设置为模板的阴性对照和空白对照。以SY5Y细胞基因组、水、cDNA进行分别PCR，再将三者的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（图3-3）。本研究的目的是鉴定SY5Y细胞中GBA基因的表达，所以在设计PCR和琼脂糖凝胶电泳实验时，本研究是以已知的GBA基因为模板设计的PCR引物，所以在PCR的过程中，只有和GBA相关的外显子为底物才能生成PCR产物。因为基因组DNA中既有内含子也有外显子，而cDNA是由RNA逆转录产生的，只含有外显子。本研究PCR体系中有以SY5Y细胞RNA为模板反转录生成的cDNA，若在cDNA的电泳道中有条带存在，就可以证明有GBA基因的表达。本研究的凝胶电泳结果如图3-4所示，cDNA的电泳道中有条带存在，证明了SY5Y细胞中有GBA基因的表达。

华南理工大学硕士学位论文28图3-3GBA基因表达鉴定电泳图图注：第一列为DL2000Marker，第二列为水（空白对照），第三列为基因组（阴性对照），第四列为cDNA，第五列为β-actin（内参）为了进行靶序列的鉴定，本研究通过依据数据库中的GBA基因DHSs片段的基因序列，在DHS两端剪切位点各延长400bp设计引物进行PCR扩增。再对扩增产物进一步执行纯化操作，最后将纯化的产物进行琼脂糖凝胶电泳。本研究就得到了如图3-2的琼脂糖凝胶电泳图。本研究可以通过观察靶序列扩增纯化电泳图中目的条带的外观状况来判断本研究之前靶序列扩增纯化的结果是否良好。如图3-5所示，目的泳道只有单一条带，且该条带与DL2000marker比对的大小（1451bp）也与本研究设计的结果相吻合。该条带外外观条件清晰明亮，说明本研究的扩增纯化结果较为良好，可以进一步将纯化结果送至测序公司测序。本研究从测序公司获得的测序结果如图3-4所示。本研究再将本次的测序结果与数据库中已有的GBA基因的基因序列进行比对，发现在整个测序结果中仅有3个位点的数据和数据库中的基因序列存在差异，并且这三个差异位点都为于本研究DHSs片段的两端，不在本研究的敲除范围内，所以对本研究的实验结果没有影响。由此可以证明本研究的目标DHSs片段存在于SY5Y细胞的基因组中，且与数据库中的基因序列吻合，该SY5Y细胞可以用于本研究下一步的敲除实验。


本文编号：3231947