神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病的实验研究

发布时间：2017-04-27 23:08

  本文关键词：神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：随着人们生活水平的提高,和社会环境的不断改变,阿尔茨海默病(Alzheimer'S disease, AD)的发病率却呈现了不断且快速上升的趋势,根据大量的医学研究资料显示,对于阿尔茨海默病至今还没有特效药物以及治疗方法。本实验是用纯化了的绿色荧光蛋白(green fluorecent protein,GFP)转基因小鼠的胚胎神经干细胞(neural stem cells, NSCs),进行分离、培养,然后移植到APP/PS1双转基因小鼠脑内的海马中。探讨神经干细胞在修复患鼠脑组织过程中的作用,从而为临床应用神经干细胞来治疗阿尔茨海默病提供理论依据。 方法：(1)E14的GFP转基因小鼠内的胚胎,取其端脑,制成神经干细胞悬液进行培养,并进行免疫荧光细胞化学技术来检测所培养干细胞巢蛋白(Nestin)的表达。同时用胎牛血清来诱导神经干细胞进行分化,用MAP-2(神经元特异烯醇化酶),GFAP(胶质纤维酸性蛋白)免疫细胞化学染色,对其所分化成的神经元和星形胶质细胞进行鉴定。(2)E14的C57小鼠内的胚胎,用上述方法制成神经干细胞悬液进行培养,传至4-6代时,以每孔8×104—1×105个细胞/500μl的密度接种于24孔板内,按照复染指数(Multiplicities of infection,MOI)为0,1,5,10,15,20加入携带有GFP基因的慢病毒载体(lent iviral vector-GFP,LV/GFP)稀释液,每六孔为一滴度,共六组。2-3天后置于倒置荧光显微镜下观察其GFP的阳性表达。以流式细胞仪检测各组各组神经干细胞的GFP阳性转染率。 (3)根据脑立体定位技术将含有GFP基因的神经干细胞移植到AD小鼠脑内海马中,一周后做水迷宫与旷场试验,以检测小鼠的学习与记忆能力是否有所改善。移植四周后取小鼠脑部采用荧光技术来检测移植后,神经干细胞的存活及迁移能力。 结果：体外实验充分证明,从E14的胎鼠端脑内可以成功的分离培养出神经干细胞,并且此细胞中绝大多数可以表达神经干细胞的标志物——巢蛋白(Nestin);在胎牛血清分化培养基的诱导下,神经干细胞具有多方向分化的潜能,其中少数干细胞可以分化成被MAP-2表达的神经元,多数可以分化成被GFAP所表达的星形胶质细胞。 神经干细胞转染GFP基因后,除MOI=0组以外,2-3天后各孔的GFP均有表达。且随着MOI值的增加而阳性表达率亦增加。MOI=0-10时,P0.05。 通过行为学检测,在学习与记忆能力上,细胞移植组的小鼠比模型组有差异(P0.05),与对照组比较差异无显著性(P0.05).免疫组织化学技术检测：移植后的神经干细胞不仅能够可以很好与AD小鼠的脑组织进行整合,而且可以在AD小鼠脑组织内进行迁移。 结论：神经干细胞在无血清完全培养基培养下可以很好的存活,并且大量增殖。移植脑组织海马区后可以完成迁移与整合。神经干细胞对阿尔茨海默病的治疗有一定疗效。同时慢病毒可以作为将外源基因转入到神经干细胞的理想载体。
【关键词】：阿尔茨海默病 神经干细胞 移植 GFP转基因小鼠
【学位授予单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 英文缩写5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 引言10-12
• 文献综述12-30
• 综述112-22
• 1 阿尔茨海默病的流行病学12
• 2 现代医学对AD的认识和研究12-14
• 2.1 AD的历史12-13
• 2.2 AD的诊断13
• 2.3 AD的病理学13-14
• 3 中医学对AD的认识14-15
• 3.1 古籍对AD的描述14-15
• 3.2 中医学对AD病因病机的认识15
• 4 AD的治疗15-17
• 4.1 西医治疗15-16
• 4.2 中医治疗16-17
• 5 阿尔茨海默病的模型17-22
• 5.1 单转基因小鼠19-20
• 5.2 双转基因小鼠20
• 5.3 三转基因小鼠20-22
• 综述222-30
• 1 神经干细胞的概念22
• 2 神经干细胞的分布22-23
• 3 神经干细胞的来源23
• 4 神经干细胞的增殖、分化与鉴定23-26
• 5 神经干细胞的研究方向26
• 6 人类神经干细胞的研究26-28
• 7 神经干细胞用于AD治疗的可行性28
• 8 神经干细胞治疗AD面临的问题28
• 9 神经干细胞应用前景28-30
• 材料与方法30-39
• 1 实验材料30-32
• 1.1 实验动物及分组30
• 1.2 主要试剂/试剂盒30
• 1.3 仪器设备30-31
• 1.4 主要溶液配制31-32
• 2 实验方法32-33
• 2.1 神经干细胞的单细胞悬液制备32-33
• 2.2 半量换液方法33
• 2.3 传代培养33
• 3 神经干细胞的鉴定--巢蛋白(Nestin)33-34
• 4 神经干细胞的诱导分化、鉴定34
• 4.1 神经干细胞的诱导分化34
• 4.2 神经干细胞分化的鉴定34
• 5 慢病毒转染神经干细胞34-35
• 6 行为学35-36
• 7 移植36-37
• 8 脑组织的取材和冰冻切片制备37
• 9 脑组织切片HE染色37-38
• 10 统计学处理38-39
• 结果39-42
• 1 神经干细胞的培养与鉴定39-40
• 1.1 神经干细胞的原代及传代培养39
• 1.2 神经干细胞的鉴定39
• 1.3 神经干细胞的分化以及分化鉴定39-40
• 1.4 神经干细胞的慢病毒转染检测40
• 2 神经干细胞对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆的影响40
• 2.1 旷场实验40
• 2.2 Morris水迷宫实验40
• 3 神经干细胞对APP/PS1双转基因小鼠脑组织的影响40-42
• 讨论42-46
• 1 阿尔茨海默病动物模型42
• 2 移植后神经干细胞存活42-43
• 3 移植神经干细胞后的迁移43-44
• 4 慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞44
• 5 移植神经干细胞后APP/PS1小鼠的行为学改变44-45
• 6 移植神经干细胞治疗阿尔茨海默病的可能机制45
• 7 应用展望45-46
• 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-57
• 附录57-62
• 攻读博、硕士学位期间发表的论文62-64
• 个人简历64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 应春怡 ,陈汝筑 ,汪雪兰 ,陈系古;神经系统退行性疾病相关的tau蛋白及其转基因动物模型[J];中华神经医学杂志;2005年01期

2 耿佃盛,韩恩吉;神经生长因子与老年性痴呆[J];国外医学.神经病学神经外科学分册;2000年03期

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本文编号：331609