川芎嗪烃基哌嗪衍生物CXC137对NMDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤及血管性痴呆模型大鼠保护作用研究

发布时间：2017-05-06 08:14

  本文关键词：川芎嗪烃基哌嗪衍生物CXC137对NMDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤及血管性痴呆模型大鼠保护作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】： 血管性痴呆是发生在脑血管基础上的以记忆、认知功能缺损为主,或伴有语言、视空间技能及情感或人格障碍的获得性智能持续性损害的综合征。血管性痴呆产生原因多为脑梗塞导致脑缺血-再灌注引起的脑实质损伤。当今研究表明：兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤和神经细胞凋亡是缺血-再灌注导致的脑实质损伤进而引起血管性痴呆的主要分子生物学机制。 川芎嗪是中药川芎的主要有效成分之一,具有清除氧自由基、钙拮抗、扩血管、抗血小板聚集和血栓形成等多种作用,广泛应用于临床治疗。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化,生成极性和水溶性较大的代谢物而迅速被排出体外,所以川芎嗪存在半衰期短,生物利用度低等缺点。本课题选用的化合物CXC137,是以氟桂利嗪的主要药效基团二苯甲基-1-哌嗪基甲基基团取代川芎嗪的药代基团2位甲基而合成出的新型川芎嗪烃基哌嗪类衍生物。氟桂利嗪为第2代哌嗪类钙拮抗药,能通过血脑屏障,选择性扩张血管,预防缺血、缺氧引起的细胞内Ca2+超载所致细胞损害,临床上广泛用于心脑血管疾病和外周血管功能不全的防治。以氟桂利嗪的活性基团取代川芎嗪分子的药代基团,以期克服川芎嗪体内半衰期短、生物利用度低等缺点,并通过协同作用增强药效,提高抗心脑血管疾病作用。 本研究第一部分以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)作用于人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),模拟体内兴奋性氨基酸毒性造成的神经细胞损伤,第二部分采用双侧颈总动脉结扎并降压的方法制作大鼠血管性痴呆模型。实验目的为从不同方面探讨CXC137对NMDA诱导的神经细胞损伤和抗凋亡的作用机制,以及对血管性痴呆模型大鼠的药理学作用,为进一步开发该化合物治疗神经系统疾病提供理论基础。同时,以传统中药的有效成分为先导化合物,在构效关系研究的基础上对其进行结构改造和优化,为充分利用我国丰富的天然植物资源进行创新药物研究提供依据。 1.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞活力的影响 采用MTT法检测细胞活力。实验结果显示：SH-SYSY细胞经NMDA200μmol／L损伤后,细胞活力明显降低(P0.01)。而溶媒组(3%oDMSO)对细胞活力无影响。同时发现,NMDA损伤前或损伤后给予CXC137均对细胞损伤具有保护作用(P0.01)。 2.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞LDH释放率的影响 收集氧化损伤处理后的细胞培养上清液和细胞裂解液,参照试剂盒说明分别测定培养上清液和细胞裂解液中的LDH活性,计算细胞LDH释放率。实验结果表明：NMDA损伤后SH-SY5Y细胞LDH释放率显著增高(P0.01)。与模型组相比,CXC137处理后可明显降低细胞LDH释放率(P0.01)。 3.流式细胞术检测细胞凋亡率 细胞经处理后,以Annexin V-FITC／PI双染后上流式细胞仪检测。实验结果表明,与正常组比较,模型组细胞的凋亡率明显升高(P0.01)。与模型组比较,CXC137各浓度组细胞的凋亡率明显降低,且呈剂量依赖性关系,差异有显著统计学意义(P0.01)。 4.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内Caspase-3蛋白活性及表达的影响 使用Caspase-3活力检测试剂盒和Western Blot检测Caspase-3活力和表达。实验结果表明：加入NMDA后,Caspase-3蛋白活性及表达均明显升高(P0.01),CXC13720、40和80μmol／L三个剂量组均可显著降低Caspase-3活力和蛋白表达水平(P0.05或P0.01)。 5.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内游离钙浓度的影响 细胞悬液以荧光探针Fura-3／AM负载后,置多功能酶标仪检测荧光强度,检测波长为λem=490 nm/λex=526nm。实验结果表明：加入NMDA损伤后细胞内钙离子浓度升高(P0.01)。给予20、40、80μmol／L CXC137后,细胞内钙离子浓度均显著降低(P0.01)。 6.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞ATP含量的影响 收集细胞裂解液,用考马斯亮蓝法定细胞内总蛋白量。按ATP含量检测试剂盒说明书测定细胞ATP含量。实验结果表明：加入NMDA后,细胞内ATP含量明显降低(P0.01)。给予20、40、80μmol／L CXC137后,ATP含量显著升高(P0.01)。 7.DPPH*法测定CXC137体外清除自由基能力 将不同浓度的抗氧化剂加入DPPH*后,在516nm处的紫外吸光度会发生改变,用以检测化合物清除自由基的能力。实验结果表明：50mg／ml CXC137体外自由基清除率在40%左右,具有一定的清除自由基的能力。但清除能力不如维生素E和TMP。 8.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞MDA、GSH含量,SOD活力的影响 收集细胞裂解液,用考马斯亮蓝法定细胞内总蛋白量,按MDA、GSH、SOD检测试剂盒说明书测定细胞内MDA、GSH含量、SOD活力。实验结果表明：加入NMDA后,细胞内MDA生成量显著增高(P0.01)。与NMDA组相比,40、80μmol／L CXC137组细胞内MDA生成量均明显减少(P0.01)。加入NMDA后,细胞内SOD活力和GSH含量均显著降低(P0.01)。与NMDA组相比,40、80μmol／L CXC137组细胞SOD活力和GSH含量均明显升高(P0.01)。 9.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内NO含量和NOS活性的影响 收集细胞裂解液,用考马斯亮蓝法定细胞内总蛋白量,按NO、NOS检测试剂盒说明书测定细胞内NO含量和NOS活性。实验结果表明：SH-SY5Y细胞的NO含量,在NMDA损伤后开始升高,在加入NMDA后24h达到最高峰,随后含量开始下降,加入80μmol／L CXC137和氟桂利嗪后,SH-SY5Y细胞的NO含量均有所下降。SH-SY5Y细胞的tNOS和iNOS的含量,在NMDA损伤后开始升高,在加入NMDA后12h达到最高峰,随后含量开始下降,在36-48h时降至正常水平；加入80μmol／L CXC137和氟桂利嗪后,SH-SY5Y细胞的tNOS和iNOS含量均有所下降。 10.CXC137对血管性痴呆模型大鼠行动能力的影响 前肢抓握实验是动物实验中常用的检查动物行动能力的实验方法,方法简便、快捷。手术后第30日经行前肢抓握实验用以检测实验大鼠行动能力,并进行评分结果表明：反复结扎双侧颈总动脉后,动物的行动能力有所降低,给予CXC137治疗后,动物行动能力有所提高。 11.CXC137对血管性痴呆模型大鼠空间学习记忆能力的影响 本实验采用Morris水迷宫检测大鼠的空间记忆能力,包括定位航行实验和空间探索实验两项检测指标。在定位航行实验中,模型组大鼠测试成绩最差,逃避潜伏期比假手术组明显延长(p0.01)；另外空间探索实验中,穿越平台次数和在平台所在象限停留时间均显著减少(p0.01),表明双侧颈总动脉结扎造成大鼠脑慢性缺血,4周后模型大鼠已出现显著的学习记忆能力损害,而给予80mg／kgCXC137后,大鼠定位航行实验逃避潜伏期有所降低,空间探索实验中,穿越平台次数和在平台所在象限停留时间均显著增高(p0.01)。 12.CXC137对血管性痴呆模型大鼠脑内谷氨酸含量的影响 收集实验大鼠脑组织匀浆,用考马斯亮蓝法定细胞内总蛋白量,按谷氨酸含量检测试剂盒说明书测定组织谷氨酸含量。实验结果表明：双侧颈总动脉反复结扎并降压后,大鼠脑组织匀浆中谷氨酸含量明显升高(P0.01)。与模型组相比,20、80mg／kg CXC137能够降低脑组织中谷氨酸含量(p0.05)。 13.CXC137对血管性痴呆模型大鼠脑内MDA、GSH含量和SOD活性的影响 收集实验大鼠脑组织匀浆,用考马斯亮蓝法定细胞内总蛋白量,按MDA、GSH含量检测试剂盒说明书测定组织MDA、GSH含量,按SOD活性检测试剂盒说明书测定组织SOD活性。实验结果表明：双侧颈总动脉反复结扎并降压后,大鼠脑组织匀浆中MDA含量明显升高(P0.01)；SOD活性和GSH含量明显降低(P0.01)。与模型组相比,20、80mg／kg CXC137能够降低脑组织中MDA含量(P0.01),80mg／kgCXC137能够升高组织SOD活性和GSH含量(P0.01)。 14.CXC137对血管性痴呆模型大鼠脑内NO含量及NOS活性的影响 收集实验大鼠脑组织匀浆,用考马斯亮蓝法定细胞内总蛋白量,按NO含量检测试剂盒说明书测定组织NO含量,按NOS活性检测试剂盒说明书测定组织NOS活性。实验结果表明：双侧颈总动脉反复结扎并降压4周后,大鼠脑组织匀浆中NO含量和NOS活性无显著变化(无统计学差异)。 15.CXC137对血管性痴呆模型大鼠脑内线粒体的影响 线粒体悬液的浑浊度可反映线粒体肿胀度,其吸光度越高说明线粒体肿胀程度越高,线粒体损伤越严重。实验结果表明：双侧颈总动脉反复结扎并降压4周后,大鼠脑内线粒体肿胀度明显升高(P0.01),说明双侧颈总动脉反复结扎并降压能损伤大鼠脑线粒体；给予20,40mg／kgCXC137后,大鼠脑线粒体肿胀度显著降低(P0.05)。
【关键词】：川芎嗪烃基哌嗪衍生物 NMDA 血管性痴呆 细胞凋亡 SH-SY5Y细胞株
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R749.13
【目录】：

• 目录4-10
• 中文摘要10-15
• Abstract15-20
• 符号说明20-22
• 第一部分 CXC137对NMDA诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤的影响22-57
• 前言22-25
• 实验材料25-28
• 实验方法28-33
• 1.细胞培养28
• 2.实验项目及检测指标28-32
• 2.1 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞存活力的影响28-29
• 2.1.1 MTT法检测细胞存活力28-29
• 2.1.2 LDH释放率测定29
• 2.2 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞凋亡的影响29-30
• 2.2.1 流式细胞术检测细胞凋亡率29-30
• 2.2.2 Caspase-3试剂盒检测Caspase-3活力30
• 2.2.3 Western Blot检测CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内Caspase-3蛋白表达的影响30
• 2.3 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内游离钙浓度的影响30-31
• 2.4 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内ATP含量的影响31
• 2.5 CXC137对自由基的影响31-32
• 2.5.1 DPPH~*法测定CXC137体外清除自由基能力31-32
• 2.5.2 酶生化法测定细胞内MDA、GSH含量、SOD活力32
• 2.6 细胞内NO含量和NOS活性的测定32
• 3.数据处理32-33
• 实验结果33-49
• 1.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞活力的影响33-36
• 1.1 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞存活力的影响33-34
• 1.2 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞LDH释放率的影响34-36
• 2.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞凋亡的影响36-40
• 2.1 流式细胞术检测细胞凋亡率36-38
• 2.2 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内Caspase-3蛋白活性及表达的影响38-40
• 3.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内游离钙浓度的影响40-41
• 4.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内ATP含量的影响41-42
• 5.CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内自由基的影响42-46
• 5.1 DPPH~*法测定CXC137体外清除自由基能力42-43
• 5.2 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内MDA、GSH含量,SOD活力的影响43-46
• 5.2.1 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞MDA含量的影响43-44
• 5.2.2 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内SOD活性的影响44
• 5.2.3 CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内GSH含量的影响44-46
• 6. CXC137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内NO含量和NOS活性的影响46-49
• 讨论49-57
• 第二部分 CXC137对血管性痴呆模型大鼠的保护作用研究57-73
• 前言57
• 实验材料57-59
• 实验方法59-61
• 1.实验动物分组59
• 2.大鼠血管性痴呆模型制备及给药59
• 3.前肢抓握实验59
• 4.Morris水迷宫实验59-60
• 5.生化指标检测60-61
• 5.1 标本采集60
• 5.2 谷氨酸、MDA、GSH、NO含量,SOD、NOS活性测定60-61
• 5.3 线粒体提取及线粒体肿胀度61
• 5.3.1 线粒体提取61
• 5.3.2 线粒体肿胀度检测61
• 6.数据处理61
• 实验结果61-69
• 1.CXC137对血管性痴呆模型大鼠行动能力的影响61-62
• 2.CXC137对血管性痴呆模型大鼠空间学习记忆能力的影响62-64
• 3.CXC137对血管性痴呆模型大鼠脑内谷氨酸含量的影响64-65
• 4.CXC137对血管性痴呆模型大鼠脑内MDA、GSH含量和SOD活性的影响65-67
• 5.CXC137对血管性痴呆模型大鼠脑内NO含量及NOS活性的影响67-68
• 6.CXC137对血管性痴呆模型大鼠脑内线粒体的影响68-69
• 讨论69-73
• 结论73-74
• 参考文献74-79
• 致谢79-80
• 攻读硕士学位论文期间发表的论文80-81
• 发表论文81-98
• 学位论文评阅及答辩情况表98

【引证文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 张伟;超声强化超临界CO_2提取复方川芎丹参及其提取物药效研究[D];华南理工大学;2011年

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本文编号：348066