A2AR活化在脑创伤后tau蛋白过度磷酸化及认知障碍中的作用与机制

发布时间：2017-05-10 02:11

  本文关键词：A2AR活化在脑创伤后tau蛋白过度磷酸化及认知障碍中的作用与机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着社会的发展，由交通事故、战争以及激烈对抗运动导致的创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)及伤后远期认知功能障碍的发生率逐年增高。TBI后认知障碍起病隐匿，多在伤后几年或数十年发病，并可进行性发展。对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等神经退行性疾病的研究表明tau蛋白过度磷酸化与认知功能障碍的发生有关。近来有研究发现TBI后患者脑中存在异常过度磷酸化的tau蛋白。但是，tau蛋白过度磷酸化是否与TBI后慢性期认知功能障碍的发生有关仍不明确。研究发现PKA、GSK-3β是大脑中引起tau蛋白发生过度磷酸化反应的主要激酶，PKA可以易化GSK-3β对tau蛋白的磷酸化作用。颅脑创伤后细胞内腺苷合成增多或直接由ATP转化的腺苷增加导致脑内腺苷含量迅速升高，并激活腺苷A2A受体(AdenosineA2A receptor，A2AR)。A2AR在调节多种神经递质的释放、神经兴奋性、突触可塑性、胶质细胞的功能以及认知功能方面发挥重要作用，PKA是A2AR活化后发挥生物效应的经典下游分子之一。抑制A2AR的活化可改善脑创伤后的某些认知功能障碍。但目前还不知道在脑外伤这一致病条件下，，抑制A2AR活化对认知功能的保护效应是否与降低tau蛋白磷酸化水平有关，如果有关又是通过什么信号通路对tau蛋白磷酸化水平进行调控的。 我们的研究中，首先在左侧顶叶皮层固定位置应用可控皮质打击方法(Controlledcortical impact，CCI)建立TBI模型，通过检测伤后24h小鼠脑含水量及神经功能缺损评分，达到了本实验室前期建立的小鼠中度TBI模型标准。应用免疫组织化学及western blot方法检测TBI致伤后24小时、7天、4周不同脑区tau蛋白在Thr205、Ser262及Ser404位点磷酸化水平改变。我们发现伤后各时间点小鼠伤灶周围皮层、伤侧海马及损伤对侧海马齿状回等脑区tau蛋白C端Ser404位点磷酸化水平与假手术组相比显著升高。同时发现，在发生tau蛋白C端过度磷酸化的脑区也存在着GFAP抗体标记的星形胶质细胞增生、Neun抗体标记的神经元数量减少及淀粉样肽前体蛋白(amyloidprecursor protein，APP)堆积显示的轴突损伤。进而，我们通过在伤后15min于小鼠腹腔注射A2AR特异性抑制剂ZM241385或使用A2AR基因敲除小鼠观察各脑区tau蛋白磷酸化水平是否改变以及认知功能能否得到缓解。发现TBI后抑制A2AR的活化可以显著降低tau蛋白C端Ser404位点磷酸化水平。伤后7天、4周进行行为学检测，发现认知功能(参考记忆、工作记忆)也可得到不同程度的缓解。进而我们通过培养原代大鼠海马神经元及人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，在A2AR激动剂CGS241385的作用下分别或同时使用PKA特异性抑制剂H-89及CGS-3β抑制剂SB216763，检测tau蛋白Ser404位点磷酸化水平，发现A2AR活化对tau蛋白的磷酸化作用可能是通过活化PKA，易化GSK-3β对tau蛋白Ser404位点的磷酸化作用实现的。 主要实验结果及结论： 1、TBI后在伤侧皮层海马及对侧海马齿状回存在tau蛋白的过度磷酸化，这一磷酸化主要体现在其C端的Ser404位点，而突出区结构域(projection domain，P区)的Thr205位点及微管结合区(microtubule binding domain，MBD区)的Ser262位点磷酸化水平始终未见显著改变。这一效应不仅存在于伤后早期24小时，在亚急性期(伤后7d)及慢性期(伤后4w)tau蛋白在该位点的磷酸化水平依然高于假手术组。以上结果表明TBI后持续存在tau蛋白C端过度磷酸化，而且有不同于其他神经退行性疾病的时空分布特点。进一步实验发现伤后各时间点在发生tau蛋白过度磷酸化的对侧齿状回及邻近脑区还同时存在胶质增生、神经元丢失及轴突损伤等重要神经病理改变。这些病变发生于与学习记忆功能密切相关的海马齿状回脑区，根据tau蛋白过度磷酸化可以损伤轴浆运输功能的文献报道，以上结果提示我们TBI后慢性期认知功能障碍可能与过度磷酸化的tau蛋白引起轴浆运输功能受损及齿状回神经元丢失有关。 2、行为学实验发现TBI后拮抗A2AR或基因敲除可在伤后亚急性期及慢性期不同程度改善小鼠空间参考记忆及工作记忆功能障碍。对各组小鼠大脑进行免疫组织化学检测发现拮抗A2AR活化可显著降低损伤对侧齿状回tau蛋白C端Ser404位点的磷酸化水平，改善胶质增生、轴突损伤及神经元丢失等病理改变。以上结果提示TBI后抑制A2AR活化对认知功能的保护作用可能与降低tau蛋白的磷酸化水平有关。细胞实验发现特异性激活A2AR可使原代海马神经元细胞中的tau蛋白Ser404位点磷酸化水平升高，并呈现出神经元轴突对线粒体的运输功能障碍。这进一步肯定了中枢神经系统中A2AR活化对tau蛋白的磷酸化作用及其通过影响轴浆运输功能损伤神经元发挥神经毒性的一面。 3、在SH-SY5Y细胞中分别抑制PKA、GSK-3β或联合使用二者都可显著降低A2AR活化引起的tau蛋白磷酸化水平升高。联系其他研究中所发现的PKA、GSK-3β对tau蛋白磷酸化作用位点及两种激酶相互作用关系的报道，我们认为TBI后A2AR活化引起tau蛋白磷酸化水平升高是通过激活PKA，易化了GSK-3β对tau蛋白C端Ser404位点的磷酸化作用实现的。 上述研究结果表明，脑创伤后A2AR的活化是导致tau蛋白磷酸化水平升高进而导致认知功能障碍的重要原因，这一作用是通过激活PKA易化GSK-3β对tau蛋白C端Ser404位点的磷酸化作用实现的。tau蛋白过度磷酸化后可能通过损伤轴浆运输的方式导致神经元功能障碍甚至死亡。这一机制的证明可为创伤性脑损伤甚至其他类型认知障碍相关疾病的治疗提供重要的实验依据。
【关键词】：创伤性脑损伤 A2A受体 tau蛋白 认知功能障碍
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.12
【目录】：

• 缩略语表5-6
• Abstract6-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-16
• 1.1 选题缘由12
• 1.2 研究背景12-14
• 1.3 研究意义14
• 1.4 研究内容14-15
• 1.5 研究方法15-16
• 第二章 TBI 后 A2AR 活化是引起 tau 蛋白 C 端过度磷酸化导致认知功能障碍的重要因素的验证16-44
• 2.1 材料与方法16-24
• 2.2 实验结果24-40
• 2.3 讨论40-43
• 2.4 小结43-44
• 第三章 TBI 后 A2AR 活化引起 tau 蛋白 C 端过度磷酸化进而引起认知功能障碍的机制研究44-55
• 3.1 材料与方法44-49
• 3.2 结果49-52
• 3.3 讨论52-54
• 3.4 小结54-55
• 全文总结55-56
• 参考文献56-60
• 文献综述一 Tau 蛋白生理功能及在相关疾病中致病机制研究进展60-73
• 参考文献70-73
• 文献综述二 创伤性脑损伤后的临床症状及神经病理改变73-80
• 参考文献78-80
• 攻读学位期间的研究成果80-81
• 致谢81

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