过表达Hsp75削弱小胶质细胞可溶性因子对神经干细胞毒性作用与机制的研究

发布时间：2017-06-09 17:10

  本文关键词：过表达Hsp75削弱小胶质细胞可溶性因子对神经干细胞毒性作用与机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的神经退行性疾病。其临床表现为记忆力、抽象思维能力和语言功能的减退,情感和行为异常,丧失工作能力和独立生活能力。目前临床用于治疗AD的药物主要有作用于胆碱能神经系统的药物,其中多数为胆碱酯酶抑制剂。此外,还有N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体阻断剂等。但是,这些药物只能用来预防及缓解AD的发生及发展,并不能起到根治的作用。因此,寻求新的治疗AD的方法成为了目前关注的焦点。近年来,干细胞技术不断地完善与提高,给AD的治疗带来了曙光。但是,自从人们提出用神经干细胞技术治疗AD的构想以来,无论是通过促进AD患者内源性神经细胞生成还是通过外源性移植神经干细胞治疗AD都未取得明显的进展,提示AD患者颅内“微环境”的改变可能影响着脑内神经干细胞的生存和功能的发挥。我们的前期研究已经证实：AD患者颅内“微环境”的改变与β-淀粉样蛋白(Aβ)密切相关,其能刺激小胶质细胞释放炎性因子及趋化因子导致神经干细胞的失能。因此,寻求一种方法来削弱Aβ通过小胶质细胞对神经干细胞造成的损害成为了本课题研究的主要目的。近年来,线粒体在AD的研究已经成为了一个热点；线粒体不仅为细胞提供能量,也参与了细胞凋亡和坏死的调控。我们的前期研究已经证实,线粒体病变与AD存在着密切的关系,特别是AD颅内环境中的炎性因子加剧了线粒体的损伤。大量研究证明：线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)在维持线粒体功能、调控细胞的凋亡和坏死中起着重要的作用。mPTP是一个横跨于线粒体内外膜由多种蛋白质组成的非选择性通道,在正常的生理情况下呈关闭的状态或者低通透性的状态,仅分子量不超过1.5kDa的小分子物质才能通过这一孔道；但是在异常的病理情况下,mPTP呈高通透状性态,会引起线粒体的肿胀和外膜的破裂,细胞色素C (cytochrome c, Cytc)等促凋亡物质释放入细胞浆中,激活caspase酶,最终导致细胞的凋亡和坏死,这一过程也称线粒体依赖性凋亡途径。目前,关于mPTP的确切成分存在着许多争议,但是越来越多的研究认为线粒体基质内亲环素D(Clophilin D, CypD)是mPTP的主要成分,也是mPTP形成的启动子；在外界相关刺激因素下,CypD介导了mPTP的形成与开放。热休克蛋白75 (heat shock protein 75, Hsp75)也称为肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor necrosis factor receptor associated protein 1),其主要定位于线粒体,是一种线粒体蛋白,属于Hsp90家族的成员之一。既往研究已经证实：Hsp75的合成受外界多种环境刺激的影响,包括低糖、缺血缺氧、紫外照射等。此外,Hsp75在维持线粒体功能和调控细胞的死亡也起着至关重要的作用,越来越多的研究表明：Hsp75是一个抗凋亡的蛋白,特别是在心肌细胞及肿瘤细胞中都已证实了其抗凋亡的作用；但是关于Hsp75在阿尔茨海默病中的作用及其机制,在国内外的研究中还尚未报道。基于上述研究,本课题建立了一个Transwell共培养系统,将神经干细胞和小胶质细胞分别接种于共培养系统的下室和上室以观察两种细胞间非接触性的相互作用。通过构建携带Hsp75基因的腺病毒去感染神经干细胞,使神经干细胞过表达Hsp75蛋白,研究Hsp75蛋白在Aβ刺激小胶质细胞释放可溶性介质对神经干细胞影响中的作用,并进一步从分子水平上去探讨Hsp75蛋白是否通过CypD依赖的mPTP这一通路去调控细胞的功能。本研究成果丰富了AD发病机制的理论基础,也为今后AD的临床治疗提供了技术支持。方法1.重组腺病毒Ad-Hsp75-GFP的构建利用PCR的方法扩增Hsp75基因,凝胶电泳鉴定；pHBAd-MCMV-GFP载体质粒和目的基因Hsp75经酶切、片段回收、连接后,获得重组质粒pHBAd-MCMV-Hsp75-GFP。通过酶切、测序鉴定后,将该重组质粒和骨架质粒共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Hsp75-GFP,行PCR鉴定和TCID50法进行病毒滴度的测定。2.神经干细胞C17.2和小胶质细胞BV-2的培养C17.2神经干细胞培养于10%胎牛血清、5%马血清的DMEM高糖培养基中,于37℃的5%C02培养箱中培养,每2天换液1次,并于显微镜下观察细胞的生长情况。待细胞生长至占培养瓶底面积约80-90%时,弃去培养基,用PBS缓冲液洗两次,加入1ml的胰酶消化细胞；当细胞在镜下呈收缩渐渐变圆时弃去胰酶,加入含10%FBS的DMEM培养基吹打终止消化。吹打均匀后,用细胞计数板进行计数接种于新的培养瓶,于37℃、5%C02培养箱中继续培养,取第3-7代的细胞用于后续实验。BV-2细胞的培养方法与C17.2细胞的培养方法类似,只需将培养基换为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基即可。3.重组腺病毒感染C17.2神经干细胞及相关检测将C17.2细胞接种于6孔板(或96孔板),接种密度为2x105个/孔(或lx104个/孔),培养基为含10%胎牛血清、5%马血清的DMEM高糖培养基。置于37℃、5%CO2的孵箱中培养,12h后去除培养基,用PBS漂洗2次,添加感染复数为100的腺病毒液和1ml无血清DMEM高糖培养基,感染2h后弃去含病毒的培养基,用PBS漂洗2次,换2ml含10%胎牛血清、5%马血清的DMEM高糖培养基,于孵箱中继续培养36h后,进行如下相关检测：(1)在荧光显微镜下观察GFP荧光的表达情况。(2)弃去培养基,用PBS漂洗2次,胰酶消化收集细胞,PBS重悬制细胞悬液,用流式细胞仪检测腺病毒在C17.2细胞中的感染率。(3)于倒置相差显微镜下,观察细胞感染前和感染后的形态。(4)对感染前后的神经干细胞进行免疫细胞化学检测,采用神经干细胞特异性抗体nestin进行标记,DAPI对细胞核进行复染,并于荧光显微镜下观察。(5)对感染前后的神经干细胞进行MTT的活性检测,步骤如下：腺病毒感染36h后,弃去培养基,PBS漂洗3次,于每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl,37℃培养箱中避光孵育4 h,弃去上清液,加入150μl的二甲基亚砜(DMSO),震荡混匀使结晶充分溶解,以酶标仪490nm波长检测OD值。(6)对感染前后的神经干细胞行Western blot检测：用细胞裂解液处理细胞,离心后取上清,BCA法测蛋白质含量,10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,将蛋白半干转至PVDF膜上,封闭液封闭后,加入Hsp75多克隆抗体和β-actin小鼠单克隆抗体,之后用辣根过氧化物酶结合的二抗结合,ECL法显色后扫描。4.Aβ1-42多肽的准备将Aβ1-42溶解于35%的乙腈中,使用PBS稀释到储存浓度10mM。将稀释后的药物放置于37℃的培养箱中老化48h,促进Aβ1-42的聚集和纤维化,置于-20℃的冰箱中保存；使用时用培养基稀释到工作浓度10μM即可。5. Transwell共培养体系的构建及分组(1)空白对照组(Control):C17.2细胞培养于下室,上室不接种BV-2细胞,用正常培养基培养。(2)Aβ1-42直接作用组(NSCs+Aβ1-42):C17.2细胞培养于下室并加入终浓度10μMAβ1-42的培养基。(3)共培养对照组(NSCs-MG):C17.2与BV-2以1：1的密度分别接种于共培养体系的下室和上室,用正常的培养基培养。(4)Aβ1-42作用的共培养组(NSCs-MG+Aβ1-42):C17.2与BV-2以1：1密度分别接种于共培养体系的下室和上室,培养体系为终浓度10 μM Aβ1-42的培养基(5)腺病毒阴性感染组(Ad-GFP+Aβ1-42):感染了阴性腺病毒的C17.2神经干细胞与正常BV-2小胶质细胞以1：1的密度分别接种于共培养体系的下室和上室,培养体系为终浓度10μM Aβ1-42的培养基(6)腺病毒阳性感染组(Ad-Hsp75+Aβ1-42):感染了携带目的基因腺病毒的C17.2神经干细胞与正常BV-2小胶质细胞以1：1的密度分别接种于共培养体系的下室和上室,培养体系为终浓度10μMAβ1-42的培养基。6.流式细胞仪分析神经干细胞的凋亡率按照各实验分组的情况分别对各组施加处理因素后,收集细胞,用预冷的PBS洗2次,然后用试剂盒专用的Binding buffer重悬细胞,加入5μl的Annexin V-APC,室温避光孵育15min后再加入5μl的7-AAD试剂,上流式机检测神经干细胞的凋亡率。7. TMRE染色法分析神经干细胞线粒体的膜电位按照分组处理后,弃去培养基,用预冷的PBS漂洗2次,加入终浓度为100nM的TMRE染液,37℃下避光孵育15min, PBS漂洗3次后,于荧光显微镜下拍照。8. Western blot检测神经干细胞中Hsp75、Cytc、CypD、Caspase-3蛋白的表达按照分组处理后,弃去培养基,收集各组细胞提取总蛋白,BCA进行蛋白定量,用Western blot方法检测各组的Hsp75、CypD、Caspase-3、Cytc蛋白的表达水平。9. q-PCR检测神经干细胞中CypD、Caspase-3的mRNA表达按照分组处理后,弃去培养基,收集各组细胞提取总RNA,用q-PCR方法检测各组CypD和Caspase-3的mRNA表达水平。10.统计学处理文章数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,结果均使用均数±标准误(X±SEM)表示,多组间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。方差齐时采用最小显著性差异法(LSD法)；方差不齐时则采用Dunnett's T3法。p0.05为差异有统计学意义。结果1.重组腺病毒Ad-Hsp75-GFP的成功构建PCR扩增Hsp75基因后,产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示：在约2100bp处可见特异性片段。所获的重组质粒pHBAd-MCMV-Hsp75-GFP经酶切鉴定显示有2100bp和5300bp两条带,与预期结果一致；经测序结果比对后,与目的序列完全匹配。然后,将该重组质粒和骨架质粒共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Hsp75-GFP,行PCR鉴定可获得与预期大小一致2100bp的片段。采用TCID50方法进行病毒滴度的测定,病毒的滴度可达1×1010　PFU/ml。2.重组腺病毒成功感染C17.2神经干细胞重组腺病毒感染C17.2细胞,36h后,置于荧光显微镜下观察,大部分细胞有绿色荧光蛋白的表达；经流式细胞仪检测,腺病毒感染C17.2细胞的感染率约为85%；在倒置相差显微镜下和荧光显微镜下观察到,细胞感染前后其形态无明显的改变,nestin表达也无明显的改变；经MTT检测感染前后细胞的活性,表明感染前后细胞的活性无明显的变化；此外,Western blot检测结果表明：Ad-Hsp75-GFP组与正常组(Control)和腺病毒阴性感染组Ad-GFP相比,Hsp75蛋白表达量明显增加(p0.05)。3.Hsp75蛋白表达随着小胶质细胞可溶性因子处理时间的延长而增加实验中我们使用Ap1-42刺激小胶质细胞释放可溶性因子处理神经干细胞,探讨小胶质细胞释放的可溶性因子对神经干细胞Hsp75蛋白表达水平的影响,Aβ1-42处理时间分别为6h、12h、24h、36h、48h。我们发现：与空白对照组相比,Aβ1-42直接作用组的神经干细胞Hsp75蛋白明显增加(P0.05),然而共培养对照组并无显著性的差异(P0.05)；Aβ1-42作用的共培养组与空白对照组相比,随着Aβ1-42处理时间的增加Hsp75表达也逐渐增加,均具有显著性意义(P0.05),但在48h时开始有所下降。基于上述的实验结果选取36h作为后续实验Aβ1-42处理的时间。4.Hsp75蛋白降低神经干细胞的凋亡率实验中我们使用Aβ1-42刺激小胶质细胞释放可溶性因子处理神经干细胞,探讨Hsp75蛋白在小胶质细胞释放可溶性因子对神经干细胞凋亡率的影响,Aβ1-42处理时间为36h。我们发现：与空白对照组相比较,Aβ1-42直接作用组的神经干细胞凋亡率显著增加(P0.05),然而共培养对照组的凋亡率无明显的变化(P0.05)；与空白对照组相比较,Aβ1-42作用的共培养组和腺病毒阴性感染组的凋亡率显著增加,具有统计学意义(P0.05),然而后两组相比较并无显著性意义(P0.05)；与Aβ1-42作用的共培养组和腺病毒阴性感染组相比较,腺病毒阳性感染组的干细胞凋亡率明显下降,具有统计学意义(P0.05)。提示神经干细胞过表达Hsp75蛋白能够减弱Aβ1-42刺激小胶质细胞释放可溶性因子对其的神经毒性。5.Hsp75蛋白保护神经干细胞线粒体的膜电位实验中我们使用Aβ1-42刺激小胶质细胞释放可溶性因子处理神经干细胞,探讨Hsp75蛋白在小胶质细胞释放可溶性因子对神经干细胞线粒体膜电位的影响,Aβ1-42处理时间为36h。我们发现：与空白对照组相比较,Aβ1-42直接作用组的神经干细胞线粒体膜电位显著下降(P0.05),然而共培养对照组的线粒体膜电位无明显的变化(P0.05)；与空白对照组相比较,Aβ1-42作用的共培养组和腺病毒阴性感染组的线粒体膜电位显著下降,具有统计学意义(P0.05),然而后两组相比较并无显著性意义(P0.05)；与Aβ1-42作用的共培养组和腺病毒阴性感染组相比较,腺病毒阳性感染组的干细胞线粒体膜电位明显逆转,膜电位显著增高,具有统计学意义(P0.05)。提示神经干细胞过表达Hsp75蛋白能够减轻Aβ1-42刺激小胶质细胞释放可溶性因子导致的线粒体膜电位丢失。6.Hsp75蛋白减弱神经干细胞Cytc释放和降低神经干细胞CypD、Caspase-3的表达实验中我们使用Aβ1-42刺激小胶质细胞释放可溶性因子处理神经干细胞,探讨Hsp75蛋白能否削弱小胶质细胞释放可溶性因子导致神经干细胞mPTP的开放及是否通过调节线粒体依赖的凋亡途径发挥对神经干细胞的保护作用,Aβ1-42处理时间为36h。从结果中我们可知：与空白对照组相比较,Aβ1-42直接作用组的Cytc蛋白释放显著增加(P0.05),然而共培养对照组的Cytc蛋白释放无明显的变化(P0.05)；与空白对照组相比较,Ap1-42作用的共培养组和腺病毒阴性感染组的Cytc蛋白释放量显著增加,具有统计学意义(P0.05),然而后两组相比较并无显著性意义(P0.05)；与Aβl-42作用的共培养组和腺病毒阴性感染组相比较,腺病毒阳性感染组的干细胞Cytc蛋白释放量明显下降,具有统计学意义(P0.05)。同样地,我们通过Western blot的检测和q-PCR的定量分析获得caspase-3蛋白和mRNA的表达结果均与上述Cytc释放的结果一致。这提示我们：Hsp75蛋白过表达减弱神经干细胞Cytc释放,从而降低caspase-3酶的活化,阻断了线粒体依赖的凋亡途径。为了进一步明确Hsp75蛋白在小胶质细胞释放可溶性因子对神经干细胞CypD表达中所起的作用,我们采用Western blot和q-PCR来检测神经干细胞CypD蛋白的表达和mRNA的表达。我们发现：与空白对照组相比较,Aβ1-42直接作用组的CypD含量显著增加(P0.05),然而共培养对照组的CypD含量无明显的变化(P0.05)；与空白对照组相比较,Aβ1-42作用的共培养组和腺病毒阴性感染组的CypD含量显著增加,具有统计学意义(P0.05),然而后两组相比较并无显著性意义(P0.05)；与Aβ1-42作用的共培养组和腺病毒阴性感染组相比较,腺病毒阳性感染组的干细胞CypD含量明显下降,具有统计学意义(P0.05)。类似地,我们采用q-PCR方法对神经干细胞CypD mRNA表达进行定量分析,所获得的结果与上述CypD蛋白定量结果一致。这提示着：Hsp75蛋白的过表达降低了mPTP形成的启动子即CypD的表达。结论1.成功克隆了人的Hsp75基因,并构建了人Hsp75复制缺陷型腺病毒载体(Ad-Hsp75-GFP),为下一步感染神经干细胞做了准备。2.重组腺病毒成功感染C17.2神经干细胞,感染效率高且无毒性,证实了腺病毒感染C17.2神经干细胞是一种可行且安全的方法。3.小胶质细胞可溶性因子诱导神经干细胞Hsp75表达的增多,并且随着处理时间的延长,Hsp75蛋白增加越明显,是神经干细胞的一种内源性保护反应。4.在小胶质细胞可溶性因子处理神经干细胞的情况下,神经干细胞过表达Hsp75蛋白能够减轻可溶性因子诱导的神经毒性即凋亡率下降、膜电位丢失减少。5.Hsp75蛋白能够通过减少CypD依赖型mPTP的开放,从而阻断小胶质细胞可溶性因子诱导的线粒体依赖凋亡途径的激活,起到保护神经干细胞的作用。
【关键词】：腺病毒 热休克蛋白75 神经干细胞 线粒体通透性转换孔
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-29
• 第一章 热休克蛋白75重组腺病毒载体的构建29-40
• 1. 材料与仪器29-31
• 2. 实验方法31-37
• 3. 结果37-38
• 4. 讨论38-39
• 5. 小结39-40
• 第二章 腺病毒介导Hsp75体外感染神经干细胞的实验研究40-51
• 1. 材料与仪器40-42
• 2. 实验方法42-46
• 3. 结果46-49
• 4. 讨论49-50
• 5. 小结50-51
• 第三章 神经干细胞过表达Hsp75在小胶质细胞可溶性因子诱导神经毒性中的作用51-67
• 1. 材料与仪器52-54
• 2. 实验方法54-59
• 3. 结果59-63
• 4. 讨论63-66
• 5. 小结66-67
• 参考文献67-71
• 综述71-80
• 参考文献74-80
• 附录：缩略语中英文对照表80-81
• 攻读学位期间成果81-82
• 致谢82-83

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