FP1在铅导致PC12细胞内铁聚积中的作用研究

发布时间：2017-07-02 23:00

  本文关键词：FP1在铅导致PC12细胞内铁聚积中的作用研究

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【摘要】：研究目的： 因越来越多的研究发现铅可以引起阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease, AD），使得铅的神经毒性再次备受关注成为热点问题之一，然而其机制仍未完全明了。在我们前期研究的长期铅暴露动物模型中发现铅可以引起老年大鼠脑铁过载。众所周知，脑铁过载是阿尔兹海默病的病因。因此，我们有理由认为铅引起铁过载进而导致神经退行性疾病。然而，铅是通过何种途径或机制引起脑铁过载尚不清楚。故本研究建立体外培养的大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞系即PC12细胞铅暴露模型，探讨铅暴露对细胞内铁稳态的影响及铁转入蛋白二价金属离子转运体（divalent metal transporter1, DMT1）和铁转出蛋白膜铁转运蛋白（ferroportin1, FP1）在其中的作用。 实验方法： （1）PC12细胞置于37℃、5%CO2培养箱内培养，分别在不同铁环境下（正常铁环境、10μM硫酸亚铁、100μM去铁胺）以浓度梯度（0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM）的醋酸铅处理细胞24、48和72小时（h）后，使用铁染色（Perl’s staining）检测细胞内铁水平的变化，使用MTT法检测细胞活力变化。 （2）浓度梯度（0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM）的醋酸铅分别处理细胞24、48和72h后，应用逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）检测细胞DMT1和FP1mRNA表达水平的变化，使用免疫蛋白印迹法（western blotting, WB）检测细胞DMT1和FP1蛋白表达水平的变化。 （3）用脂质体瞬时转染法将pFP1-EGFP-N1质粒和pEGFP-N1空载转入细胞，并通过观察绿色荧光蛋白GFP阳性细胞和免疫荧光法（Immunofluorescent,IF）检测FP1表达变化以评估转染效果。 （4）细胞转染后，再用10μM醋酸铅处理24h，使用铁染色（Perl’s staining）和铁荧光检测法（Iron fluorescence detection）检测细胞内铁水平的变化。 实验结果： （1）铅暴露引起PC12细胞内铁含量增加：Perl’s铁染色发现，铅暴露后PC12细胞内铁水平增加，且随着铅暴露浓度和时间增加呈剂量反应关系。高铁环境能加重铅引起的细胞内铁聚积。 （2）铅暴露引起PC12细胞活力下降：MTT检测显示在铅暴露24h后，PC12细胞活力在不同铁环境下的各浓度铅暴露组间比较差异无统计学意义（P0.05）；在铅暴露48和72h后，PC12细胞活力下降，，且随着铅暴露浓度和时间的增加呈剂量反应关系。此外，在高铁环境下，这种剂量反应下降表现更为严重。 （3）铅暴露影响DMT1的表达：RT-PCR检测发现，DMT1(-IRE)表达水平仅在高浓度（100μM）铅暴露24h后较对照组上升（P0.05）。DMT1(+IRE)mRNA表达水平在铅暴露24h后，随着铅浓度增加呈现剂量反应上升，而在铅暴露48和72h后，随着铅浓度增加呈现剂量反应下降（P0.05）。Western blotting检测发现，在铅暴露24h后，PC12细胞DMT1蛋白表达水平增加，且随着铅暴露浓度增加呈剂量反应关系。但随着铅暴露时间延长至72h后，PC12细胞DMT1蛋白表达水平降低，且随着铅暴露浓度增加呈剂量反应关系。 （4）铅暴露引起FP1的表达下降：RT-PCR检测发现，仅在铅暴露72h后，PC12细胞FP1mRNA表达水平在10-100μM铅暴露组较对照组降低（P0.05）。Western blotting检测发现，在铅暴露24、48和72h后， PC12细胞内FP1的蛋白表达水平降低，且随着铅暴露浓度和时间增加呈剂量反应关系。 （5）FP1高表达减轻铅暴露后细胞内铁聚积的程度：PC12细胞经脂质体转染FP1质粒和空载后，免疫荧光检测发现，质粒转染组FP1蛋白表达水平增加为空载转染对照组的3.3倍（P0.05）。转染后细胞用10μM醋酸铅处理24h，Perl’s铁染色发现，质粒转染组细胞内铁水平是空载转染对照组细胞内铁水平的0.4倍（P0.05）。铁荧光检测发现，质粒转染组细胞内铁水平是空载转染对照组细胞内铁水平的0.33倍（P0.05）。 结论: 铅暴露引起PC12细胞内铁聚积是下调FP1表达水平所致，而可能与DMT1表达水平变化无关。故FP1可能成为阻止铅引起神经细胞铁过载及随后发展的神经退行性变的新靶点。
【关键词】：铅 铁 膜铁转运蛋白1 二价金属离子转运体1 高表达
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 缩略词表10-12
• 第1章 前言12-16
• 第2章 铅暴露对 PC12 细胞活力及胞内铁水平的影响16-29
• 2.1 概述16
• 2.2 材料和方法16-24
• 2.2.1 材料16-21
• 2.2.2 方法21-24
• 2.3 结果24-26
• 2.3.1 Perl’s 染色检测铅暴露后 PC12 细胞内铁水平24-26
• 2.3.2 MTT 检测铅暴露后 PC12 细胞的活力26
• 2.4 讨论26-28
• 2.5 小结28-29
• 第3章 铅暴露对 PC12 细胞铁转运蛋白 DMT1 和 FP1 表达的影响29-47
• 3.1 概述29
• 3.2 材料和方法29-39
• 3.2.1 材料29-35
• 3.2.2 方法35-39
• 3.3 结果39-46
• 3.3.1 RT-PCR、WB 检测铅暴露 PC12 细胞 DMT1 表达变化39-43
• 3.3.2 RT-PCR、WB 检测铅暴露 PC12 细胞 FP1 表达变化43-46
• 3.4 讨论46
• 3.5 小结46-47
• 第4章 FP1 高表达对铅暴露的 PC12 细胞内铁聚积的影响47-60
• 4.1 概述47
• 4.2 材料和方法47-53
• 4.2.1 材料47-50
• 4.2.2 方法50-53
• 4.3 结果53-59
• 4.3.1 测序及跑胶鉴定 FP1 质粒53-54
• 4.3.2 GFP 荧光表达检测质粒转染效果54-55
• 4.3.3 免疫荧光(IF)检测转染后目的蛋白表达量55-56
• 4.3.4 Perl’s 染色检测 FP1 高表达对细胞内铁聚积影响56-57
• 4.3.5 铁荧光检测 FP1 高表达对细胞内铁聚积影响57-59
• 4.4 讨论59
• 4.5 小结59-60
• 第5章 结论60-61
• 5.1 概述60
• 5.2 主要结论60
• 5.3 本课题创新之处60-61
• 致谢61-62
• 参考文献62-68
• 附录68-74
• 攻读学位期间的研究成果74-75
• 综述75-81
• 参考文献78-81

  本文关键词：FP1在铅导致PC12细胞内铁聚积中的作用研究

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本文编号：511531