星形胶质细胞溶酶体与β-淀粉样蛋白的相互作用机制研究

发布时间：2017-07-17 11:23

  本文关键词：星形胶质细胞溶酶体与β-淀粉样蛋白的相互作用机制研究

  更多相关文章： Aβ 星形胶质细胞 溶酶体 Forskolin

【摘要】：目的:1.研究Aβ处理对星形胶质细胞溶酶体的p H、体积及数目的变化,阐明Aβ对星形胶质细胞溶酶体功能的影响。2.用bafilomycin A1抑制质子泵,观察溶酶体pH、数目变化及溶酶体对外源性Aβ降解的影响。3.研究用NH4Cl处理星形胶质细胞后观察其对外源性Aβ降解的影响。4.研究forskolin对星形胶质细胞溶酶体的p H、体积及数目的变化,明确forskolin对星形胶质细胞溶酶体功能的影响。5.阐明forskolin处理对溶酶体降解Aβ的影响。6.研究forskolin处理对细胞内总Aβ含量的影响,阐明forskolin对星形胶质细胞Aβ含量的影响。方法:取新生1~3天小鼠的大脑皮层,进行原代星形胶质细胞培养。纯化后用胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的单克隆抗体标记细胞骨架,鉴定培养的细胞为星形胶质细胞。将活细胞用DND-99标记以便于动态观察溶酶体变化。用200 nM的Aβ42孵育细胞30 min后,给予细胞250 nM的bafilomycin A1处理30 min(或用200μM的forskolin处理45 min),1μM的DND-99孵育30 min,活细胞成像观察溶酶体的p H、体积及数目的变化。用200 nM带绿色荧光标记的Aβ42孵育细胞30 min后,分别给予250 nM的bafilomycin A1和25mM的NH4Cl处理30 min(或用200μM的forskolin处理45 min),活细胞成像观察细胞内Aβ含量的影响。用200 nM的Aβ42孵育细胞30 min后,用200μM的forskolin处理45 min,裂解细胞并用ELISA方法检测内源性Aβ42的含量。结果:1.外源性Aβ42经星形胶质细胞内吞后定位到溶酶体。2.Aβ42处理使细胞溶酶体pH降低、溶酶体体积变大以及溶酶体数目减少。3.细胞经bafilomycin A1碱化以后,溶酶体数目减少;经bafilomycin A1处理以后,内吞的Aβ42在细胞内聚集。4.细胞经NH4Cl酸化以后,外源性Aβ42在细胞内的聚集减少。5.Forskolin处理使细胞溶酶体p H降低、溶酶体体积变大以及溶酶体数目减少;Forskolin处理使外源性Aβ42在细胞内聚集;Forskolin处理使内源性Aβ42的量增加。结论:Aβ处理星形胶质细胞30 min后定位到溶酶体。Aβ聚集在星形胶质细胞溶酶体中损伤溶酶体正常功能,导致溶酶体数目减少。Forskolin处理与Aβ处理产生类似的效果,并促使外源性Aβ在溶酶体中的积累,最终导致溶酶体数目的减少。Forskolin导致溶酶体功能损伤的机制可能与其激活PKA信号通路,促使内源性Aβ产生并积累到溶酶体有关。
【关键词】：Aβ 星形胶质细胞 溶酶体 Forskolin
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-13
• 1 实验材料与方法13-21
• 1.1 实验材料13-17
• 1.1.1 感受态细胞与质粒13
• 1.1.2 抗生素13
• 1.1.3 实验用试剂盒13
• 1.1.4 细胞培养相关试剂13-14
• 1.1.5 细胞转染相关试剂14
• 1.1.6 细胞药物处理14
• 1.1.7 常用溶液的配方14-16
• 1.1.8 主要抗体及荧光染料来源16
• 1.1.9 主要仪器设备16
• 1.1.10实验动物16-17
• 1.2 实验方法17-21
• 1.2.1 质粒转化与提取17
• 1.2.2 可溶性Aβ42的制备17
• 1.2.3 小鼠皮质星形胶质细胞的原代培养17-18
• 1.2.4 小鼠星形胶质细胞转染18
• 1.2.5 小鼠星形胶质细胞免疫细胞化学18-19
• 1.2.6 ELISA检测19
• 1.2.7 Aβ42和药物处理19-20
• 1.2.8 共聚焦显微图像的获取及分析20
• 1.2.9 数据统计20-21
• 2 实验结果21-32
• 2.1 星形胶质细胞纯化鉴定21
• 2.2 LysoTracker Red DND-99可以用于标记活细胞溶酶体21-22
• 2.3 星形胶质细胞内吞Aβ 后定位到溶酶体22-23
• 2.4 用不带荧光的Aβ42处理，观察溶酶体功能变化23-24
• 2.4.1 Aβ42处理后，溶酶体变酸23
• 2.4.2 Aβ42处理后，溶酶体体积变大、数目减少23-24
• 2.5 质子泵抑制剂Bafilomycin A1使溶酶体数目减少24-26
• 2.6 Bafilomycin A1处理使Aβ 在细胞内聚集，无法被溶酶体有效降解26
• 2.7 NH_4Cl处理加速Aβ 在细胞内的降解26-27
• 2.8 Forskolin对星形胶质细胞溶酶体功能的影响27-30
• 2.8.1 Forskolin使星形胶质细胞溶酶体变酸27-28
• 2.8.2 Forskolin处理使星形胶质细胞溶酶体体积变大、数目减少28-30
• 2.9 Forskolin处理细胞使外源性Aβ 在细胞内聚集30-31
• 2.10 Forskolin处理细胞使内源性Aβ 的产生增加31-32
• 3 讨论32-36
• 4 结论36-37
• 参考文献37-41
• 附录A 文献综述41-52
• 参考文献49-52
• 在学研究成果52-53
• 致谢53

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本文编号：553372