CYP19A1及雌激素对阿尔茨海默病作用的研究

发布时间：2017-07-30 13:37

  本文关键词：CYP19A1及雌激素对阿尔茨海默病作用的研究

  更多相关文章： 阿尔茨海默病 雌激素 CYP19A1

【摘要】：目的：探究CYP19A1基因的过表达及雌激素对阿尔茨海默病细胞模型的影响,为阐述CYP19A1、雌激素与阿尔茨海默病的内在关系提供实验依据。方法：1.取胎龄为18-19d的C57BL/6J胎鼠,分离海马组织。采用胰酶消化法进行原代培养,倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态,采用微管蛋白相关标志物2(MAP2)及Hoechst 33258免疫荧光染色鉴定海马神经元纯度。2.用Aβ25-35处理海马神经元建立阿尔茨海默病细胞模型。设不同浓度梯度的Aβ25-35作用于海马神经元48h,用CCK-8法检测细胞活性,确定Aβ25-35最佳AD模型造模浓度。3.用不同浓度的17β-雌二醇作用加入到Aβ25-35处理的阿尔茨海默病细胞模型中,48h后用CCK-8法检测细胞活性,以及用Hoechst 33258染核检测细胞凋亡情况。4.利用模板质粒H4134,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出CYP19A1基因片段；用限制性内切酶Spe I-HF和XbaI酶酶切pLenti-CMV-EGFP-P2A-MCS-3FLAG(H138)表达载体；使用无缝克隆试剂盒将CYP19A1基因片段和线性化载体连接；运用PCR方法鉴定阳性克隆的pLenti-CMV-EGFP-P2A-CYP19A1载体。使用Obio转染试剂进行慢病毒包装,运用定量聚合酶链反应(qPCR)法行滴度检测；并用重组慢病毒转染人胚肾细胞(293T),观察GFP表达并用Western Blot检测目的质粒的表达情况。从而构建CYP19A1过表达慢病毒。5.CYP19A1过表达慢病毒转染海马神经元,72h后用Aβ25-35处理造模。48h后,用CCK-8法检测细胞活性,用Hoechst 33258染核检测细胞凋亡情况。成果：1.本课题所采用方法培养的海马神经元生长状态良好,且能稳定存活至3w；神经元的纯度可达95%。2.稳定建立了海马神经元阿尔茨海默病细胞模型,确立Aβ25-35的造模浓度为20uM。3.10-4 mol/L、10-5mol/L浓度17β-雌二醇可对抗Aβ25-35处理的海马神经元阿尔茨海默病细胞模型的活性损伤和细胞凋亡,对海马神经元有保护作用。4.成功获得了阳性克隆的pLenti-CMV-EGFP-P2A-CYP19A1载体。并成功转染了293T细胞,目的质粒在细胞中成功表达。成功构建了CYP19A1过表达慢病毒。5. CYP19A1过表达慢病毒能在海马神经元中成功转染,海马神经元经过CYP19A1过表达慢病毒转染后能对抗Aβ25-35处理的海马神经元阿尔茨海默病细胞模型的活性损伤和细胞凋亡。结论：在阿尔茨海默病细胞模型中CYP19A1过表达及雌激素可对抗由Aβ25-35引起的活性损伤和细胞凋亡,即CYP19A1过表达及雌激素对阿尔茨海默病具有保护作用。
【关键词】：阿尔茨海默病 雌激素 CYP19A1
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 引言10-12
• 第一章 文献研究12-17
• 1.1 阿尔茨海默病12-13
• 1.1.1 概述12
• 1.1.2 流行病学12
• 1.1.3 病理特征及发病机制12-13
• 1.1.4 遗传因素13
• 1.2 雌激素与阿尔茨海默病13-15
• 1.2.1 阿尔茨海默病患病率的性别差异13-14
• 1.2.2 雌激素对阿尔茨海默病的作用14
• 1.2.3 雌激素对阿尔茨海默病的作用机制14-15
• 1.3 CYP19A1与阿尔茨海默病15-17
• 1.3.0 CYP的简介15
• 1.3.1 CYP19A1的简介15
• 1.3.2 CYP19A1与阿尔茨海默病的研究进展15-17
• 第二章 海马神经元的培养与鉴定17-23
• 2.1 实验材料17-18
• 2.1.1 实验动物17
• 2.1.2 主要耗材17
• 2.1.3 主要实验试剂17
• 2.1.4 主要仪器设备17-18
• 2.1.5 主要溶液配制18
• 2.2 实验方法18-20
• 2.2.1 原代海马神经元的培养18-19
• 2.2.2 免疫荧光鉴定海马神经元19-20
• 2.3 实验结果20-21
• 2.3.1 原代海马神经元20-21
• 2.3.2 海马神经元免疫荧光鉴定21
• 2.4 讨论21-23
• 第三章 雌激素对Aβ_(25-35)诱导的阿尔茨海默病细胞模型的作用23-30
• 3.1 实验材料23-24
• 3.1.1 实验动物23
• 3.1.2 主要耗材23
• 3.1.3 主要实验试剂23
• 3.1.4 主要仪器设备23
• 3.1.5 主要溶液配制23-24
• 3.2 实验方法24-25
• 3.2.1 原代海马神经元的培养24
• 3.2.2 药物处理24
• 3.2.3 细胞活力检测24-25
• 3.2.4 海马神经元凋亡的检测25
• 3.3 统计学分析25-26
• 3.4 实验结果26-29
• 3.4.1 Aβ_(25-35)最佳造模浓度26
• 3.4.2 DMSO溶媒稀释比的选择26-27
• 3.4.3 17β-雌二醇对Aβ_(25-35)损伤的阿尔茨海默病细胞模型的作用27-29
• 3.5 讨论29-30
• 第四章 CYP19A1过表达慢病毒的构建及鉴定30-45
• 4.1 实验材料30-31
• 4.1.1 质粒、菌株与细胞30
• 4.1.2 主要耗材30
• 4.1.3 主要酶与试剂30
• 4.1.4 主要仪器设备30-31
• 4.1.5 1主要溶液配制31
• 4.2 实验方法31-41
• 4.2.1 CYP19A1荧光表达载体的构建31-36
• 4.2.2 过表达CYP19A1的慢病毒包装及纯化36-41
• 4.3 实验结果41-44
• 4.3.1 CYP19A1序列的PCR扩增41-42
• 4.3.2 CYP19A1载体酶切测序结果42-43
• 4.3.3 慢病毒滴度的测定43
• 4.3.4 目的质粒的表达情况的检测43-44
• 4.4 讨论44-45
• 第五章 CYP19A1过表达对阿尔茨海默病细胞模型的作用研究45-52
• 5.1 实验材料45
• 5.1.1 实验动物45
• 5.1.2 主要耗材45
• 5.1.3 主要实验试剂45
• 5.1.4 主要仪器设备45
• 5.1.5 主要溶液配制45
• 5.2 实验方法45-47
• 5.2.1 慢病毒感染海马神经元的最适感染复数的确定45-46
• 5.2.2 CCK-8检测慢病毒转染对AD细胞模型活性影响46
• 5.2.3 Hoechst 33258检测慢病毒转染对AD细胞模型凋亡的影响46-47
• 5.3 统计学分析47
• 5.4 实验结果47-50
• 5.4.1 最适感染复数的确定47-49
• 5.4.2 CYP19A1过表达对Aβ_(25-35)引起的海马神经元活性损伤的影响49
• 5.4.3 CYP19A1过表达对Aβ_(25-35)引起的海马神经元凋亡的影响49-50
• 5.5 讨论50-52
• 结语52-53
• 参考文献53-57
• 附录57-58
• 在校期间发表论文情况58-59
• 致谢59-60
• 统计学审核证明60

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 逢迎春　,王寿先,宋保华;早年生活危险因素与阿尔茨海默病的发生[J];国外医学(儿科学分册);2000年06期

2 ;阿尔茨海默病患者常有额叶损害[J];河南医学研究;2000年03期

3 柴延丰,陈哲宇;阿尔茨海默病研究又有新进展[J];中国神经科学杂志;2000年04期

4 菲琳;;可缓解阿尔茨海默病病情的新药[J];国外医学情报;2000年02期

5 汪义朋,王建枝;早老素-1对阿尔茨海默病相关蛋白调节的可能途径[J];中华神经科杂志;2001年01期

6 邵千里;15例阿尔茨海默病的诊治[J];贵阳医学院学报;2001年03期

7 ;工业化社区阿尔茨海默病发病率较高[J];河南医学研究;2001年03期

8 邵梅,汤荟冬;阿尔茨海默病天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶研究进展[J];上海第二医科大学学报;2001年05期

9 ;脑器质性精神障碍[J];国外科技资料目录.医药卫生;2001年04期

10 吴传深 ,周东丰 ,Peter Como ,张林 ,Karl Kieburtz ,范金虎 ,乔友林;河南林县阿尔茨海默病患病率的调查[J];中华精神科杂志;2002年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 陈梅芳;;阿尔茨海默病的行为和精神症状及相关因素分析[A];2009年浙江省医学会精神病学学术年会暨浙江省医师协会精神科医师分会第二届年会论文汇编[C];2009年

2 杜丽华;;阿尔茨海默病治疗[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

3 成林平;黄绍宽;李玉梅;王延平;邓晓莹;;维生素干预治疗对阿尔茨海默病患者血浆同型半胱氨酸水平的影响[A];中华医学会第八次全国老年医学学术会议论文汇编[C];2007年

4 唐微韵;;阿尔茨海默病患者照料工作中的心理慰藉问题探讨[A];第10次全国精神病学术交流会暨《中国民康医学》创刊20周年庆典论文汇编[C];2008年

5 周东升;徐银儿;连国民;于畅;陈中鸣;;老年人生活方式与阿尔茨海默病相关性研究[A];2013浙江省医学会精神病学分会学术年会暨浙江省医师协会精神科医师分会第六届年会论文汇编[C];2013年

6 于恩彦;;对阿尔茨海默病认识的进展[A];2013年浙江省医学会精神病学分会老年精神障碍学组学术会议论文汇编[C];2013年

7 郭忠伟;陈炜;;~1H-MRS在阿尔茨海默病早期诊治中的应用[A];2013年浙江省医学会精神病学分会老年精神障碍学组学术会议论文汇编[C];2013年

8 于恩彦;朱俊鹏;王珏;王欣慰;谭云飞;廖峥娈;仇雅菊;汪宏;;阿尔茨海默病的“早期-全面-系统-长期”预防[A];第七届全国心理卫生学术大会论文汇编[C];2014年

9 崔德华;;脑衰老因素在阿尔茨海默病的发病中的所起的作用及防治[A];2009全国抗衰老与老年痴呆学术会议论文汇编[C];2009年

10 陈生弟;杨红旗;孙治坤;崔佩菁;王红梅;;阿尔茨海默病的若干发病机制及治疗新靶点研究[A];2009全国抗衰老与老年痴呆学术会议论文汇编[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 编译 姚立新;阿尔茨海默病防治:缺乏灵丹妙药[N];医药经济报;2010年

2 记者 刘正午;阿尔茨海默病成欧美第二大忧患[N];医药经济报;2011年

3 长沙市第一医院神经医学中心主任、主任医师 王爱民;您了解阿尔茨海默病吗？[N];大众卫生报;2012年

4 长沙市第一医院神经医学中心主任、主任医师 王爱民;门诊可排查阿尔茨海默病[N];大众卫生报;2012年

5 本报记者 李颖;为阿尔茨海默病正名[N];科技日报;2012年

6 上海市中医老年医学研究所教授 林水淼;阿尔茨海默病权变治疗可延缓病情进展[N];健康报;2013年

7 吴志 李淼;警惕盯上老年人的“杀手”阿尔茨海默病[N];科技日报;2013年

8 孙琳 本报记者 李颖;你是否关注阿尔茨海默病？[N];科技日报;2014年

9 本报记者 李蕴明;阿尔茨海默病困局待解[N];医药经济报;2014年

10 樱子 整理;为何阿尔茨海默病患者常迷路[N];医药经济报;2014年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 吕英茹;阿尔茨海默病的MRI结构与功能研究[D];复旦大学;2014年

2 杨平;中国南方人群阿尔茨海默病易感基因筛查及可能机制[D];复旦大学;2014年

3 李毅;FDG和PiB PET显像在Alzheimer's Disease早期诊断及临床分型中的应用研究[D];山东大学;2015年

4 矫树生;依达拉奉对阿尔茨海默病的防治作用及其机制研究[D];第三军医大学;2015年

5 李工博;杀虫剂DDT和hnRNPA1基因在阿尔茨海默病中的作用及分子机制研究[D];第三军医大学;2015年

6 邓青山;DISC1改善阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因模型鼠认知功能的实验研究[D];南方医科大学;2015年

7 朱小群;磁共振波谱在轻度认知功能损害和阿尔茨海默病中的应用[D];安徽医科大学;2015年

8 姜红燕;云南汉族早发阿尔茨海默病家系的遗传学研究[D];云南大学;2015年

9 徐志鹏;糖原合成酶激酶-3β在阿尔茨海默病及2型糖尿病发病中的作用[D];华中科技大学;2015年

10 李楠;人源性阿尔茨海默病噬菌体抗体库的构建及Aβ单链抗体的筛选与初步效价研究[D];郑州大学;2016年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 蒋刚;蚁群算法在求解阿尔茨海默病最优微阵列上的应用[D];四川师范大学;2011年

2 周江霖;应用点着色聚类方法识别阿尔茨海默病致病基因[D];四川师范大学;2012年

3 付成燕;护士对阿尔茨海默病的认知及其影响因素的研究[D];泰山医学院;2014年

4 娄艳芳;非药物疗法干预阿尔茨海默病的临床疗效研究[D];河北医科大学;2015年

5 马杭琨;中药对照多奈哌齐治疗阿尔茨海默病的Meta分析[D];北京中医药大学;2016年

6 刘一川;天芪益智方对阿尔茨海默病大鼠突触功能的影响[D];北京中医药大学;2016年

7 马洪明;田金洲教授学术思想与临床经验总结及其治疗阿尔茨海默病用药规律研究[D];北京中医药大学;2016年

8 张佳佳;天芪益智颗粒对阿尔茨海默病模型大鼠炎症反应的保护作用[D];北京中医药大学;2016年

9 殷凯林;CART通过调节MAPK和AKT通路抑制β淀粉样蛋白沉积改善阿尔茨海默病认知功能的相关研究[D];南京大学;2014年

10 姜荣;V11抗阿尔茨海默病作用[D];南京大学;2014年

，

本文编号：594503