TDP-43对tau外显子10可变剪接和tau mRNA稳定性调节的研究

发布时间：2017-07-31 14:08

  本文关键词：TDP-43对tau外显子10可变剪接和tau mRNA稳定性调节的研究

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【摘要】：第一部分TDP-43在tau外显子10可变剪接中的作用 目的： 研究TDP-43（transactive response DNA-binding protein of43kDa）对tau外显子10可变剪接的影响及其分子机制。 方法： 利用tau的迷你基因pCI/SI-SI10和pCI/SI9-LI10，研究TDP-43调节tau外显子10可变剪接的机制。构建TDP-43真核表达质粒，在SH-SY5Y、N2a、HepG2、HEK-293FT、COS7、HeLa细胞和原代皮层神经元内过表达TDP-43，在HEK-293FT细胞中表达不同浓度的TDP-43或基因沉默TDP-43，利用RT-PCR方法研究TDP-43对tau外显子10可变剪接的影响。构建TDP-43的截断体及肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和泛素阳性包涵体额颞叶痴呆（frontotemporallobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions，FTLD U）相关的TDP-43突变体，研究其对tau外显子10可变剪接的影响的结构域依赖性和ALS/FTLD-U病理相关性突变对TDP-43调节tau外显子10可变剪接的影响。利用RNase保护实验原理探讨TDP-43与tau pre-mRNA结合的可能位点。 结果： 1) HEK-293FT细胞内，过表达TDP-43可以促进tau外显子10的编码，增加4R-tau的表达，这种促进作用呈剂量依赖性。在SH-SY5Y、N2a、HepG2、COS7、HeLa细胞和原代皮层神经元中，TDP-43都可以促进tau外显子10的编码。 2) TDP-43除了已经报道的一个核定位信号外，可能还含有另外一个核定位信号。 3) TDP-43的C-末端是其促进tau外显子10编码的生物学功能所必需的，但N-末端对其功能有促进作用。 4) ALS或FTLD-U疾病相关的TDP-43突变体促进4R-tau表达的能力比野生型TDP-43更强。 5) tau迷你基因的pre-mRNA上可能存在6个潜在的TDP-43结合位点，这6个位点都位于内含子9上。 结论： 本研究显示TDP-43可能通过与tau pre-mRNA的结合促进tau外显子10的可变剪接。 第二部分 蛋白激酶和磷酸酯酶对TDP-43介导的tau外显子10可变剪接的调节 目的： 研究蛋白激酶和磷酸酯酶对TDP-43的磷酸化和去磷酸化及对TDP-43介导的促进tau外显子10的可变剪接作用的影响。 方法： 免疫共沉淀方法检测TDP-43和哪些蛋白激酶、磷酸酯酶之间有相互作用。在HEK-293FT细胞中过表达TDP-43和酪蛋白激酶1（casein kinase，CK）或蛋白激酶A（cAMP dependent kinase，PKA），分别免疫纯化TDP-43、CK1和PKA,用CK1和PKA体外磷酸化TDP-43，放射自显影检测蛋白激酶对TDP-43的磷酸化或磷酸酯酶对TDP-43介导的tau外显子10的可变剪接有无影响。我们构建了磷酸化位点相关的突变体（TDP-43S379A，TDP-43S403/404A，TDP-43S409/410A），通过放射自显影观察突变后的TDP-43的磷酸化水平和野生型TDP-43相比有无改变。用PKA激活剂Forskolin或CK1抑制剂PF4800567或PP1抑制剂处理转染了TDP-43的细胞，观察其对TDP-43蛋白磷酸化的影响。 结果： 1) TDP-43和CK1、CK1有相互作用。CK1和能在体外磷酸化TDP-43。CK1抑制剂PF4800567处理能下调TDP-43的磷酸化水平。CK1抑制TDP-43促进的tau外显子10的可变剪接。 2) TDP-43和PKA c、PKAc有相互作用。PKAc和能在体外磷酸化TDP-43。PKA激活剂Forskolin处理使TDP-43磷酸化水平上升。PKA抑制TDP-43促进的tau外显子10的可变剪接。 3) PP1可使TDP-43的多个位点去磷酸化，抑制剂处理后磷酸化水平显著上升。PP1能抑制TDP-43促进的tau外显子10的可变剪接。 4)阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）患者脑组织检测结果发现，TDP-43的pS403/404、pS409/410水平增加，3R-tau的表达也增加。 结论： TDP-43的活性受蛋白激酶（CK1和PKA）和磷酸酯酶（PP1）影响，改变其磷酸化水平，抑制其促进tau外显子10可变剪接的作用。 第三部分 TDP-43调节tau mRNA的稳定性 目的： 研究TDP-43对tau mRNA的稳定性的影响。 方法： 检测N2a细胞中内源性tau的水平，用转录抑制剂放线菌素D处理转染了TDP-43的细胞，观察其对tau mRNA水平的影响。构建tau3’-非翻译区（3’-untranslated region,3’-UTR）质粒及其缺失突变体（缺失TDP-43和tau3’-UTR可能结合的TG重复序列）到pEGFP-C1载体上。HEK-293FT细胞内过表达TDP-43，和tau3’-UTR质粒或缺失突变体共转，光镜下观察绿色荧光的变化，，实时荧光定量PCR检测GFP的表达，Western blot检测蛋白表达情况。TDP-43和PKA或CK1共转，观察tau3’-UTR的表达有无变化。 结果： 1) TDP-43降低N2a细胞中内源性tau水平，siTDP-43作用相反。放线菌素D处理后，TDP-43仍能显著降低tau mRNA水平。 2) HEK-293FT细胞内，TDP-43可以呈剂量依赖性下调tau3’-UTR的表达，抑制tau mRNA的稳定性。 3) TG重复序列是TDP-43抑制tau mRNA的稳定性所必需的。 4) CK1或PKA和TDP-43共同作用能逆转TDP-43对tau3’-UTR表达的抑制作用。 结论： TDP-43可能通过和tau3’-UTR的(TG)n位点结合，抑制tau mRNA的稳定性。CK1和PKA逆转TDP-43对tau3’-UTR表达的抑制作用。
【关键词】：TDP-43 tau 可变剪接 蛋白激酶 阿尔茨海默病
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 前言13-17
• 第一部分 TDP-43 在 tau 外显子 10 可变剪接中的作用17-40
• 1. 材料和方法17-28
• 2. 结果28-37
• 3. 讨论37-39
• 4. 结论39-40
• 第二部分 蛋白激酶和磷酸酯酶对TDP-43 介导的 tau 外显子 10 可变剪接的调节40-79
• 1. 材料和方法41-50
• 2. 结果50-76
• 3. 讨论76-78
• 4. 结论78-79
• 第三部分 TDP-43 对 tau mRNA 稳定性的影响79-92
• 1. 材料和方法80-84
• 2. 结果84-89
• 3. 讨论89-91
• 4. 结论91-92
• 总结92-93
• 参考文献93-100
• 综述100-113
• 参考文献108-113
• 英文缩写词表113-115
• 附录115-117
• （一）博士期间发表和参与研究工作的论文115-116
• （二）博士期间参与的学术会议116
• （三）博士期间参与的基金项目116
• （四）博士期间访学经历116-117
• 致谢117-119

【共引文献】

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本文编号：599521