不同环境下天然无结构蛋白α-Synuclein的核磁共振研究

发布时间：2017-08-03 13:12

  本文关键词：不同环境下天然无结构蛋白α-Synuclein的核磁共振研究

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【摘要】：突触核蛋白α-synuclein(AS)是由140个氨基酸组成的天然无结构蛋白质。研究发现帕金森病的标志物——路易小体中含有大量的AS, AS的异常聚集和纤维化被认为是引起帕金森病PD的主要原因之一,因而针对该蛋白质结构,聚集和功能的研究一直是研究热点。 AS由三个部分组成：N端、NAC区域和C端。生理条件下,AS主要以游离于细胞质中的自由态为主。近年研究认为在溶液中无结构的AS其实具有部分折叠的结构。因此找到用以探测AS系综构象变化的简便灵敏探针显得尤为重要。同时,AS的聚集及纤维化机制十分复杂,至今仍不明确。基本的纤维化过程认为是AS由最初无结构状态直到形成部分折叠中间态,再到寡聚物的形成,进一步形成排列紧密的纤维。AS如何形成中间态、经历怎样的构象转变、最终形成什么样的部分折叠态的研究,能够对AS聚集机制和纤维化机制提供重要的线索。近年来的研究发现,AS的聚集和纤维化过程受环境因素的影响很大,因此,针对不同环境下AS结构的研究具有重要的意义。 本文针对以上的问题,对天然无结构蛋白质AS做了比较系统的研究。首先介绍了AS制备纯化的方法,包括未标记、非特异性同位素标记和19F特殊标记三种蛋白质标记方法。此外,我们通过体积排阻色谱和荧光监测相结合的手段摸索AS寡聚物制备的条件,制备并分离出了AS寡聚物。 运用’9F探钊,通过一维19F NMR方法能够更灵敏和直观地探测AS的构象变化。我们发现在低盐环境下AS出现了两种不同的构象,在氟谱上表现为谱图出现明显的两套谱峰。通过运用改变重水含量的溶剂诱导的同位素效应方法,我们鉴别了两种态的结构区别：一种折叠相对紧密,一种相对打开。此外,我们还提供了可能参与分子内相互作用而造成这种结构区别的残基信息。 我们通过向AS溶液中加入不同类型,不同比例的有机溶剂模拟细胞膜界面的环境,研究该环境下AS的结构,以及AS和细胞膜结合的结构,并且捕捉一些部分折叠中间态。结合氟谱、HSQC、谱峰强度比较、圆二色光谱等方法,我们观察到了AS在不同环境下构象的变化以及相应构象变化可能的折叠过程。同时在甲醇与水混合体系中,低甲醇含量(15%)的情况下可以观察到AS部分折叠中间态,形成这种部分折叠中间态被认为是AS聚集纤维化的重要过程。 本文的研究结果对于理解AS在溶液中的状态,以及AS的寡聚机制和纤维化机制有着重要的参考价值。本文运用超灵敏19F探针探测蛋白质构象变化和捕捉部分折叠中间态的实验方法,可以为其它天然无结构蛋白的研究提供参考依据。
【关键词】：液体核磁共振 氟谱 天然无结构蛋白 帕金森病 α-synuclein
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所）
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q51;R749.16
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目录9-12
• 1 引言12-23
• 1.1 天然无结构蛋白α-Synuclein简述12-16
• 1.1.1 天然无结构蛋白在生命体中广泛存在12
• 1.1.2 天然无结构蛋白AS被认为与帕金森病密切相关12-13
• 1.1.3 AS在生理条件下主要以无结构形式存在13
• 1.1.4 AS与细胞膜相互作用时会出现不同的结构13-14
• 1.1.5 AS易于纤维化,形成的纤维是路易小体的主要成分14-15
• 1.1.6 影响AS聚集的多方面因素15-16
• 1.2 核磁共振波谱学是蛋白质结构研究的手段16-22
• 1.2.1 核磁共振简介18-19
• 1.2.2 化学位移19-20
• 1.2.3 氟NMR谱在蛋白质研究中的应用20-22
• 1.3 小结22-23
• 2 天然无结构蛋白AS样品的制备23-28
• 2.1 质粒转化24
• 2.2 未标记AS的表达24
• 2.3 同位素标记的AS的表达24-25
• 2.4 ~(19)F、 ~(15)N标记的AS的表达25
• 2.5 蛋白样品的纯化25-28
• 3 低盐与高盐环境下AS构象的NMR研究28-33
• 3.1 单体AS在溶液中不是完全无结构的28-29
• 3.2 实验方法和参数29
• 3.3 实验结果29-31
• 3.3.1 AS在低盐与高盐溶液中存在不同构象29-30
• 3.3.2 通过溶剂诱导的同位素位移鉴别结构差异30-31
• 3.4 讨论31-32
• 3.5 小结32-33
• 4 含有机溶剂体系下AS的结构研究33-42
• 4.1 有机溶剂的加入能够模拟生物膜环境33-34
• 4.2 氟谱对环境十分敏感是研究结构变化很好的探针34
• 4.3 实验方法和参数34
• 4.4 结果与讨论34-40
• 4.4.1 圆二色光谱实验34-35
• 4.4.2 ~1H-~(15)N HSQC实验结果35-39
• 4.4.3 一维~(19)F谱实验39-40
• 4.5 讨论40-41
• 4.6 小结41-42
• 5 硕士期间开展的其他工作42-56
• 5.1 对AS寡聚物的研究42-49
• 5.1.1 AS寡聚物更可能是帕金森病的病因42-44
• 5.1.2 ~(14)N四极裂分能够反映结构变化44-46
• 5.1.3 实验方法46
• 5.1.4 实验结果46-49
• 5.2 硒元素细胞内代谢初步研究49-52
• 5.2.1 硒元素在细胞中的代谢49-50
• 5.2.2 实验方法50
• 5.2.3 实验结果和讨论50-52
• 5.3 ~(14)N-四极耦合常数测定序列调试52-56
• 5.3.1 组氨酸有多种存在形式52-53
• 5.3.2 ~(14)N四极耦合常数有多种测定方法53-54
• 5.3.3 样品制备及实验方法54-55
• 5.3.4 实验结果55
• 5.3.5 小结55-56
• 参考文献56-64
• 附录64-68
• 附录A 圆二色光谱操作64
• 附录B 荧光监测AS纤维化过程64-65
• 附录C BCA检测蛋白质浓度65
• 附录D 蛋白纯化时所用缓冲溶液配方65
• 裂菌缓冲液(lysis buffer)65
• 阴离子交换柱(Source Q)65
• S100分子筛65
• 附录E 所用培养基及蛋白和核酸电泳胶配方65-68
• 常规培养基配方65-66
• SDS-PAGE浓缩胶和分离胶配方66-68
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果68

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