HO-1在软脂酸诱导的神经细胞氧化应激中的作用研究

发布时间：2017-08-04 22:18

  本文关键词：HO-1在软脂酸诱导的神经细胞氧化应激中的作用研究

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【摘要】：目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种慢性神经系统退行性疾病,以进行性记忆和认知功能减退为主要表现。研究发现,AD病人脑中中、长链和极长链脂肪酸水平增加,提示饱和脂肪酸可能在AD的发生发展中发挥重要作用。氧化应激是AD的重要致病机制。软脂酸(C16)等饱和脂肪酸可通过多种机制促进活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,诱发氧化应激,在AD的发生发展中发挥重要作用。因此,利用抗氧化剂减少氧化应激引起的脑损伤,有可能成为防治AD的重要靶点。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是脑内的抗氧化酶之一,可通过其代谢产物(胆红素等)清除活性氧,减轻氧化应激对细胞造成的损伤。HO-1基因上游有抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)。核转录因子NRF2(Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2)是ARE的激活因子。正常情况下,NRF2位于胞浆,当细胞发生氧化应激时,NRF2在ERK等激酶作用下发生磷酸化,转入细胞核,启动HO-1的转录。AD病人脑中HO-1表达有增加。提示,HO-1可能通过代偿性表达增加,提高脑的抗氧化能力,来抵御AD的病理进程。本实验拟以软脂酸C16作为刺激因素,以神经母细胞瘤BE(2)-M17细胞为研究对象,在细胞水平研究在饱和脂肪酸诱发的神经细胞氧化应激状态下,HO-1的上调机制及其抗氧化作用,为寻找AD的防治靶点提供理论和实验依据。方法:1细胞培养常规培养神经母细胞瘤BE(2)-M17细胞。2 ROS含量测定DHE染色法或化学发光法检测细胞中ROS的含量。3实时定量RT-PCR检测目的基因m RNA表达水平Trizol法提取细胞总RNA。取2μg总RNA进行反转录。以18S r RNA做内参,实时定量PCR测定HO-1和NRF2 m RNA的相对表达量。4 Western blot检测目的基因蛋白表达水平提取神经细胞总蛋白,Western blot测定HO-1、NRF2和ERK蛋白的相对表达量以及p-ERK的蛋白水平。5细胞免疫荧光染色检测目的基因的定位或蛋白水平对神经细胞进行免疫荧光染色,观察细胞内HO-1和NRF2的蛋白表达水平以及NRF2的入核情况。6数据处理采用SPSS17.0统计学软件进行处理分析。数据以?x?SD表示,多组样本之间两两比较用多个均数比较的方差分析,以P0.05为差异有统计学意义。结果:1软脂酸(C16)诱导神经细胞氧化应激。给予细胞不同剂量的C16刺激2 h,DHE染色法检测细胞中的ROS水平。结果发现,与对照组相比,给予C16刺激后,细胞中的ROS呈剂量依赖性增加,并在200μM达到高峰。表明,软脂酸诱导神经细胞出现氧化应激。2氧化应激状态下,神经细胞中HO-1的表达代偿性增加。给予细胞不同剂量的C16刺激2 h,实时定量RT-PCR检测HO-1m RNA的表达,Western blot和细胞免疫荧光染色检测HO-1的蛋白表达。结果发现,与对照组相比,给予C16刺激后,细胞中HO-1的m RNA和蛋白表达均呈剂量依赖性增加。表明,氧化应激状态下,HO-1的表达代偿性增加。3 HO-1的表达上调可减轻软脂酸诱导的神经细胞氧化应激。1)氧化应激状态下,ERK激酶被激活。给予细胞不同剂量的C16刺激2 h,Western blot检测ERK激酶的表达及其磷酸化水平。结果显示,给予C16刺激后,细胞中ERK的表达没有明显改变,但p-ERK的水平呈剂量依赖性增加。表明,氧化应激状态下,ERK激酶被激活。为了进一步明确ERK的活化与HO-1的表达之间的关系,将实验分为四组:对照组,C16组,ERK抑制剂组和ERK抑制剂+C16组。Western blot检测HO-1的表达和ERK的表达及其磷酸化水平。发现,与对照组相比,单独给予C16后,HO-1的表达和p-ERK的水平明显升高;而同时给予C16和ERK抑制剂后,与单独给予C16相比,HO-1的表达和p-ERK的水平明显降低。ERK的表达各组没有明显差异。表明,HO-1的表达上调可能与ERK相关信号途径的活化有关。2)氧化应激状态下,核转录因子NRF2被活化。给予细胞不同剂量的C16刺激2 h,细胞免疫荧光染色检测ERK的底物,HO-1的上游调控因子NRF2的活性,即NRF2的入核情况。发现,给予C16刺激后,细胞核中NRF2的水平明显增加。同时,用实时定量RT-PCR和Western blot检测NRF2的表达。结果显示,与对照组相比,给予C16刺激后,NRF2的m RNA和蛋白表达均明显增加。表明,HO-1的表达上调可能与ERK活化NRF2有关。3)HO-1的表达上调可减轻软脂酸诱导的氧化应激。实验分为四组:对照组,NRF2激动剂组,C16组和NRF2激动剂+C16组。Western blot结果显示,与对照组相比,单独给予C16或NRF2激动剂后,HO-1的表达升高,而同时给予C16和NRF2激动剂后,与单独给予C16或NRF2激动剂相比,HO-1的表达升高更为明显。化学发光法检测细胞内ROS水平,结果显示,单独给予C16刺激,与对照组相比,ROS的水平明显增高;而同时给予C16和NRF2激动剂后,与单独给予C16相比,ROS的水平明显降低。表明,上调HO-1的表达可以减轻软脂酸诱导的神经细胞氧化应激。结论:1软脂酸诱导神经细胞发生氧化应激是AD的致病机制之一;2软脂酸诱导的神经细胞氧化应激状态下,HO-1的代偿性表达增加与ERK的激活,进而活化NRF2有关;3上调HO-1的表达可以减轻软脂酸诱导的神经细胞氧化应激。
【关键词】：阿尔茨海默病 软脂酸 氧化应激 血红素氧合酶-1 NF-E2相关因子2
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 英文缩写12-13
• 前言13-14
• 材料与方法14-22
• 结果22-25
• 附图25-30
• 讨论30-31
• 结论31
• 参考文献31-33
• 综述 饱和脂肪酸与阿尔茨海默病33-40
• 参考文献36-40
• 致谢40-41
• 个人简历41

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本文编号：622023