Notch信号通路在非典型抗精神病药物喹硫平促进少突胶质细胞发生中的作用

发布时间：2017-08-05 21:18

  本文关键词：Notch信号通路在非典型抗精神病药物喹硫平促进少突胶质细胞发生中的作用

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【摘要】：研究目的： 1.构建cuprizone诱导的小鼠精神分裂症动物模型，观察其精神分裂样行为、大脑髓鞘相关蛋白及Notch通路信号分子的改变。 2.观察喹硫平干预对cuprizone模型小鼠精神分裂样行为、髓鞘相关蛋白表达以及Notch信号通路的影响，探讨Notch信号通路在喹硫平促进少突胶质细胞发生中的作用。 研究方法： 本研究分为两部分进行。实验一主要观察喹硫平对cuprizone精神分裂症模型小鼠的精神分裂样行为的作用以及对大脑髓鞘相关蛋白（髓鞘碱性蛋白myelin basicprotein, MBP、2’,3’-环核苷酸3’磷酸二酯酶2',3'-Cyclic-nucleotide3'-phosphodiesterase, CNPase）、Notch1受体及其下游效应分子Hes1表达的影响。实验二经侧脑室给予Notch信号通路γ-内分泌酶抑制剂MW167，探究给药前后小鼠行为学及脑组织上述蛋白表达的改变情况。 在实验一，C57BL/6小鼠被随机分为四组：（1）阴性对照组，实验小鼠常规饲养6周；（2）对照+喹硫平组，实验小鼠常规饲养6周，同时给予喹硫平干预；（3）cuprizone模型组，实验小鼠给予cuprizone处理6周；（4）cuprizone+喹硫平组，实验小鼠同时给予cuprizone处理及喹硫平干预6周。观察指标包括：1.旷场实验、高架十字迷宫实验、Y-迷宫实验、三箱实验和筑巢实验；2.采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测大脑MBP、 CNPase蛋白表达情况；3.采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)及RT-PCR方法检测脑组织Notch1受体及Hes1蛋白表达及其mRNA丰度。 在实验二，C57BL/6小鼠被随机分为六组：（1）阴性对照组，实验小鼠常规饲养6周；（2）对照+喹硫平组，实验小鼠常规饲养6周，同时给予喹硫平干预；（3）cuprizone模型组，实验小鼠给予cuprizone处理6周；（4）cuprizone+喹硫平组，实验小鼠同时给予cuprizone处理及喹硫平干预6周；（5）对照+MW167组，实验小鼠于实验的适应性饲养时期行右侧脑室置管术，待小鼠从手术中恢复、充分适应置管1星期之后进入模型制作阶段，即常规饲养6周，自第6周开始经侧脑室给予MW167，每天给药1次，连续给药7天；（6）cuprizone+喹硫平+MW167组，实验小鼠经过置管适应期后同时给予cuprizone处理及喹硫平干预6周，自第6周开始经侧脑室给予MW167，每天给药1次，连续给药7天。观察指标包括：1.旷场实验、Y-迷宫实验和三箱实验；2.采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测大脑MBP、Hes1和Hes5蛋白表达量。研究结果： 实验一发现，小鼠经cuprizone处理后出现精神分裂样行为学表现，并且MBP,CNPase蛋白表达降低，Notch1受体、Hes1分子的表达下调；经喹硫平干预后，cuprizone模型小鼠的分裂症样行为得以改善，并且MBP, CNPase表达升高， Notch1受体、Hes1分子的表达上调。具体结果如下： 1．与阴性对照组相比，旷场实验中，CPZ组小鼠的水平运动距离、中央区滞留时间及中央区运动距离百分比均减少（P 0.01）；高架十字迷宫实验中，CPZ组小鼠进入各个臂的总次数、开臂进入次数百分比以及开臂滞留时间百分比均明显增高（P均0.01）；Y迷宫实验中，CPZ组小鼠的正确转换率明显降低（P 0.01）；三箱实验中，CPZ组小鼠在空金属网实验箱与在stranger1实验箱停留时间无统计学差异，而在stranger1实验箱停留时间明显多于在stranger2实验箱停留时间（P 0.01）；筑巢实验中，CPZ组小鼠的筑巢评分明显降低（P 0.01）。Western blot结果显示CPZ组小鼠大脑MBP，CNPase表达降低（P均0.05）；免疫荧光染色结果表明CPZ组小鼠大脑MBP荧光强度减弱（P 0.01）；Western blot及RT-PCR实验结果均表明CPZ组小鼠大脑Notch1受体、Hes1转录因子的表达下调（P均0.05）。 2.与CPZ组相比，旷场实验中，CPZ+喹硫平组小鼠的水平运动距离、中央区滞留时间、中央区运动距离百分比均明显增加（P 0.05）；高架十字迷宫实验中，CPZ+喹硫平组小鼠进入各个臂的总次数、开臂进入次数百分比以及开臂滞留时间百分比均明显增高（P 0.01）；Y迷宫实验中，CPZ+喹硫平组小鼠的正确转换率明显增高（P 0.01）；三箱实验中，CPZ+喹硫平组小鼠在stranger1实验箱停留时间明显多于在空金属网实验箱停留时间，而在stranger2实验箱停留时间明显多于在stranger1实验箱停留时间（P均0.01）；筑巢实验中，CPZ+喹硫平组小鼠的筑巢评分增高（P 0.05）。Western blot结果显示CPZ+喹硫平组小鼠大脑MBP，CNPase表达升高（P均0.05）；免疫荧光染色结果表明CPZ+喹硫平组小鼠大脑MBP荧光强度增强（P 0.05）；Western blot及RT-PCR实验结果均表明CPZ+喹硫平组小鼠大脑Notch1受体、Hes1蛋白的表达上调（P均0.05）。 实验二发现，，小鼠经cuprizone处理后出现精神分裂样行为学表现，并且MBP表达降低，Notch信号通路的下游分子Hes1、Hes5的表达下调；经喹硫平干预后，cuprizone模型小鼠的分裂样行为得以改善，并且MBP表达升高，Hes1、Hes5分子的表达上调；预先给予MW167干预，小鼠脑组织Hes1、Hes5分子表达量降低，同时喹硫平的促进髓鞘形成作用与改善精神分裂样行为作用消失。具体结果如下： 1．与阴性对照组相比，旷场实验中，CPZ组、CPZ+喹硫平组、对照+MW167组以及CPZ+喹硫平+MW167组小鼠的水平运动距离均减少（P 0.01），CPZ组和CPZ+喹硫平+MW167组小鼠中央区滞留时间及中央区运动距离百分比均减少（P 0.01）；Y迷宫实验中，CPZ组和CPZ+喹硫平+MW167组小鼠的正确转换率明显降低（P 0.05）；三箱实验中，CPZ组和CPZ+喹硫平+MW167组小鼠在空金属网所在实验箱、stranger1所在实验箱以及stranger2所在实验箱停留时间无统计学差异。Western blot结果显示CPZ组小鼠大脑Hes1, Hes5及MBP表达降低（P0.05）；免疫荧光染色结果表明CPZ组和CPZ+喹硫平+MW167组小鼠大脑MBP荧光强度降低（P均0.01）。 2.与CPZ组相比，旷场实验中，CPZ+喹硫平组小鼠的水平运动距离明显增多（P 0.01），中央区滞留时间延长（P 0.05），中央区运动距离百分比增加（P 0.01）；Y迷宫实验中，CPZ+喹硫平组小鼠的正确转换率明显增高（P 0.01）；三箱实验中，CPZ+喹硫平组小鼠在stranger1实验箱停留时间明显多于在空金属网实验箱停留时间，而在stranger2实验箱停留时间明显多于在stranger1实验箱停留时间（P均0.05）。Western blot结果显示CPZ+喹硫平组小鼠大脑Hes1, Hes5以及MBP表达升高（P均0.05）；免疫荧光染色结果表明不同区域CPZ+喹硫平组小鼠大脑MBP荧光强度增强（P均0.01）。 3.与CPZ+喹硫平组比较，旷场实验中，CPZ+喹硫平+MW167组小鼠的水平运动距离、中央区滞留时间及中央区运动距离百分比均明显减小（P均0.05）；Y迷宫实验中，CPZ+喹硫平+MW167组小鼠的正确转换率显著降低（P 0.05）；三箱实验中，CPZ+喹硫平+MW167组小鼠在stranger1实验箱停留时间与之在空金属网实验箱停留时间无显著性差异，而在stranger1实验箱停留时间明显多于在stranger2实验箱停留时间（P 0.05）。Western blot结果显示CPZ+喹硫平+MW167组小鼠大脑Hes1, Hes5以及MBP表达降低（P均0.05）；免疫荧光染色结果表明不同区域CPZ+喹硫平+MW167组小鼠大脑MBP荧光强度减弱（P均0.01）。结论： cuprizone抑制小鼠脑组织Notch信号通路，损伤髓鞘及少突胶质细胞，导致小鼠出现精神分裂样行为；非典型抗精神病药物喹硫平激活脑组织Notch信号通路，上调大脑MBP，CNPase表达并改善模型小鼠的分裂样行为学表现；使用γ-内分泌酶抑制剂MW167阻断Notch信号通路，喹硫平的抗精神病作用及促进髓鞘形成作用均消失。Notch信号通路的激活介导了非典型抗精神病药物喹硫平的促少突胶质细胞发生及抗精神病作用。
【关键词】：精神分裂症 非典型抗精神病药物 喹硫平 Notch信号通路 髓鞘相关蛋白 小鼠
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.3
【目录】：

• 缩略语表6-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-17
• 前言17-18
• 文献回顾18-31
• 1. 精神分裂症综述18-26
• 1.1 精神分裂症的病因18-19
• 1.2 精神分裂症的发病机制19-25
• 1.2.1 神经递质异常假说19-21
• 多巴胺功能亢进假说19-20
• 5-HT 功能亢进假说20
• 谷氨酸功能低下假说20-21
• GABA 氨基丁酸功能损伤假说21
• 1.2.2 神经发育障碍假说21-22
• 神经可塑性异常21-22
• 精神分裂症的结构失连接22
• 1.2.3 神经免疫和炎症假说22-23
• 1.2.4 白质髓鞘异常假说23-25
• 1.3 精神分裂症的治疗25-26
• 1.3.1 药物治疗25
• 1.3.2 胰岛素治疗25
• 1.3.3 电痉挛治疗25-26
• 1.3.4 心理治疗26
• 2. 非典型抗精神病药物（SGAs）对少突胶质细胞的作用26-27
• 3. Notch 信号通路与少突胶质细胞发育及精神分裂症发病的关系27-30
• 3.1 Notch 信号通路概况27-28
• 3.2 Notch 信号通路对少突胶质细胞的发育调控28-29
• 3.3 Notch 信号通路和精神分裂症的关系29-30
• 4. Cuprizone 诱导的 C57BL/6 小鼠精神分裂症模型：优势与特殊性30-31
• 实验一 喹硫平对 CPZ 小鼠精神分裂样行为及 NOTCH 信号通路的影响31-57
• 1 材料31-34
• 1.1 实验动物31
• 1.2 抗体及相关试剂31-32
• 1.3 常用试剂及缓冲液配置32-33
• 1.4 主要仪器和器材33-34
• 2 方法34-43
• 2.1 Cuprizone 精神分裂症模型构建34-35
• 2.2 实验分组及实验流程35-36
• 2.3 动物行为学检测方法36-39
• 2.3.1 旷场实验36
• 2.3.2 高架十字迷宫实验36-37
• 2.3.3 Y-迷宫实验37
• 2.3.4 三箱实验37-38
• 2.3.5 筑巢实验38-39
• 2.4 Western-Blot 方法39-40
• 2.4.1 蛋白样品的制备39
• 2.4.2 蛋白含量的测定39
• 2.4.3 电泳及转膜39-40
• 2.4.4 免疫显色40
• 2.4.5 凝胶图像分析40
• 2.5 免疫荧光化学染色方法40-41
• 2.5.1 小鼠脑组织取材以及冰冻切片的获取40-41
• 2.5.2 MBP 免疫荧光染色操作流程41
• 2.5.3 采图及荧光强度分析41
• 2.6 RT-PCR 方法41-43
• 2.6.1 总 RNA 提取41-42
• 2.6.2 逆转录合成 cDNA42
• 2.6.3 PCR 反应42-43
• 2.7 统计分析43
• 3 结果43-55
• 3.1 行为学实验结果43-51
• 3.1.1 旷场实验结果43-45
• 3.1.2 高架十字迷宫实验结果45-46
• 3.1.3 Y-迷宫实验结果46-47
• 3.1.4 三箱实验结果47-49
• 3.1.5 筑巢实验结果49-51
• 3.2 Western blot 实验结果51-52
• 3.2.1 髓鞘相关蛋白（MBP、CNPase）表达结果51
• 3.2.2 Hes 1 蛋白表达结果51-52
• 3.3 免疫荧光染色实验结果52-53
• 3.4 RT-PCR 实验结果53-55
• 4 讨论55-57
• 实验二 NOTCH 信号通路在喹硫平促进少突胶质细胞发生中的作用57-70
• 1 材料58
• 1.1 实验动物58
• 1.2 试剂及主要仪器58
• 1.3 干预药物58
• 2 方法58-61
• 2.1 Cuprizone 小鼠精神分裂症模型的构建58-59
• 2.2 实验分组及实验流程59-60
• 2.3 侧脑室置管手术60
• 2.4 侧脑室给药方法60
• 2.5 动物行为学检测方法60
• 2.6 Western blot 检测方法60
• 2.7 免疫荧光化学染色方法60-61
• 3 结果61-68
• 3.1 MW167 干预阻断了喹硫平治疗改善 CPZ 小鼠精神分裂样行为表现的作用61-66
• 3.1.1 旷场实验结果61-63
• 3.1.2 Y-迷宫实验结果63-64
• 3.1.3 三箱实验结果64-66
• 3.2 MW167 干预阻断了喹硫平促进 CPZ 小鼠少突胶质细胞发生的作用66-68
• 4 讨论68-70
• 小结70-71
• 参考文献71-81
• 个人简历和研究成果81-82
• 致谢82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 汪作为,方贻儒,洪武,汪栋祥,江三多;混合家系中NOTCH4基因多态与精神分裂症、心境障碍关联的研究[J];遗传;2005年06期

本文编号：626947