神经分子影像技术平台的建立-PET双靶点分子探针在AD早期诊断的基础及临床研究

发布时间：2017-08-06 07:12

  本文关键词：神经分子影像技术平台的建立-PET双靶点分子探针在AD早期诊断的基础及临床研究

  更多相关文章： ~(18)F标记 神经纤维缠结 β淀粉样蛋白 阿尔茨海默病 特异性分子探针 正电子发射计算机断层扫描 自动化放射性合成 化学动力学 生物学特性

【摘要】：一、背景阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种不可逆性、进展性神经退行性疾病,病理特征是神经细胞外β淀粉样(amyloid-β,Aβ)老年斑(senile plaques, SPs)沉积和神经细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)形成和神经元及神经突触的丢失,临床特征是记忆缺失和认知损害,通常在确诊后7-10年内死亡,AD是老年人痴呆的主要类型。AD不但给患者和家人带来巨大的痛苦,而且对家庭及卫生体系带来沉重的社会经济压力,随着大多数国家人口老龄化的加剧,这种负担在不久的将来将会凸显出来。像使用乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸调节剂对症治疗只能暂时稳定病情,而没有明显的记忆功能改善。现在还没有有效的减慢AD神经退行性改变的治疗药物,AD是目前世界上主要的健康问题。在没有理想的生物标志物的前提下,目前AD的诊断方法主要包括临床行为学测试、磁共振(resonance imaging (MRI)、正电子发射计算机断层扫描(positron emission tomography, PET)、脑脊液标志物检测。临床上,AD的诊断主要根据NIH-ADAD标准进行神经精神行为学测试,以排除其他类型的痴呆,但是,诊断准确率可以波动于50-90%,AD的确诊还是得通过脑尸解时发现病皮层有一定量的神经纤维缠结和神经炎性老年斑。因此,结合神经科学以可靠、无创诊断AD具有极其重要的价值。有效的脑内生物标志物在鉴别和随访AD高危人群及评价目前正在研究的新的治疗方面非常有用。许多科学家致力于研发具有高进脑量、病理改变区高特异性结合的靶向显像剂。PET是敏感的分子影像手段,能够体内定量分析放射性示踪剂的皮摩尔级别的浓度,从而实现从分子水平无创定位、在患者无症状时监测疾病进程,此时,计算机断层扫描(computerized tomography, CT)、MRI上尚没有明显的解剖改变。由于活检不能直接反映患者脑内淀粉样蛋白随着时间沉积的进程,PET影像检查在反映AD的自然进程方面极具价值。而且,PET放射性药物是基于段半衰期的正电子射线,因此PET可以用来无创性评价及监测药物的动力学变化。PET无创体外定量分析脑内Aβ斑块和NFTs沉积的分子影像探针为AD的早期诊断和病情进展评价提供创新技术。这些显像剂可以检测Aβ和磷酸化tau蛋白,同时能监测其随时间的变化,能够针对脑内局部或全脑的SPs和NFTs提供准确、可靠、可重复的定量分析方法,对治疗方法的筛选和评价抗Ap和抗磷酸化tau蛋白的治疗都非常重要。综上而言,PET的运用将会极大的促进AD的早期诊断,研发具有良好特性,能与淀粉样蛋白和神经纤维缠结靶向结合的分子探针非常有必要。作为定量的神经影像探针,特异性的放射性示踪剂通常需要具有一些关键的共性,即理应是脂溶性的已能通过血脑屏障,而且不能被代谢掉,同时要具有与靶组织的可逆性的特异性结合。本课题研发新的有潜能的示踪剂以能通过PET显像将淀粉样蛋白和神经纤维缠结可视化能对这些物质进行临床前评价。二、内容第一部分[18F]-THK523的核素标记及标记条件优化目的：尽管多年来AD病理机制以Ap毒性为中心,但是tau蛋白导致的病理机制今年来得到越来越多的重视。在AD病理进程中,海马及内嗅皮质NFTs的沉积,而不是神经细胞丢失、脑萎缩和炎性老年斑在痴呆病情进展中与行为学退化的严重程度呈相关性,NFTs由高度磷酸化Tau蛋白为主的双股螺旋纤维丝构成。NFTs是AD的标志性病理改变,并且与痴呆的严重程度紧密相关,因此是AD改变病程的治疗靶点之一,特异性NFTs PET分子探针在研制AD新的治疗药物中将会发挥重要作用。本课题进一步改进制备NFTs探针[18F]-THK523,建立自动化工艺。方法：改进合成高纯度[18F]-THK523保护型前体THK-7和标准品THKF-2,并进行结构鉴定和质量控制,建立远程控制的自动化[18F]-THK523制备工艺,对[18F]-THK523亲核反应动力学进行分析,优化[18F]-THK523标记条件,完成[18F]-THK523物理、化学、生物学等质量控制。结果：前体THK-7、标准品THKF-2质量控制显示其结构鉴定吻合,纯度均大于99%,细菌性和内毒素检测均为阴性。[18F]-THK523质量控制显示,[18F]-THK523的保留时间在6.12 min,标准品THKF-2的保留时间在5.93 min,前体THK-7的保留时间在12.94 min,[18F]-THK523与THK-7两者分离度较好,峰面积积分获得放化纯大于90%。[18F]-THK523澄清、透明、无沉淀,pH值为6.6-7.0,放射性浓度为12.3 mCi/mL,放射性半衰期为109±2 min,乙醇含量10%,无菌滤膜通透性压力≥0.4 MPa,细菌学和内毒素实验为阴性。[18F]-THK523达到较高的放射性合成产率(70±5%,n=6,衰减矫正到靶轰击结束),具有高放化纯(90%)和比活度(2.5±0.5Ci/μmol),整个制备过程约45-55 min。平均标记率和比活度随反应时间和温度的增加而增加。反应速率常数k随着温度的升高而增加,而与前体的浓度无关。反应动力学研究显示,保护型前体THK-7可以通过亲核反应很容易生成[18F]-THK523。第二部分[18F]-THK523的生物学特性研究目的：任何一种理想的放射性药物的代谢和分布模式对于临床前研究到临床研究都具有重要意义。本课题通过分析[18F]-THK523的生物学特性,以评价[18F]-THK523是否能做完一种理想的脑显像剂。方法：室温下放置4h测定[18F]-THK523的体外稳定性；磷酸盐(pH=7.4)／水体系中测定[18F]-THK523脂水分配系数；磷酸盐／乙醇体系中电泳测定[18F]-THK523带典性；四个[18F]-THK523剂量、浓度组的血浆蛋白结合率测定；[18F]-THK523在正常C57小鼠体内的分布；[18F]-THK523在正常C57小鼠的Micro PET显像；不同剂量[18F]-THK523急性毒性研究；放射自显影是研究放射性配体的最常用方法,可以直接比较体外PET示踪剂的放射自显影图像与体内PET图像；值得一提的是,每个显像剂的动力学需要与PET相匹配,比如说,现象剂与靶点的结合需要在PET检查的时间窗内达到平衡。一个理想的PET显像剂必须通过临床前研究证明具备这些重要的标准。结果：应用抗坏血酸防止辐射自分解后,稳定性测定显示,在室温下放置4h后,Rf仍然大于90%,适合做下一步体内外实验。通过实验测得[18F]-THK523的脂水分配系数lgP为0.99土0.06、电性为不带电荷及血浆蛋白结合率较低且不具有质量浓度依赖性,同时[18F]-THK523为小分子(分子量仅为281)。综上而言[18F]-THK523满足脑显像剂的基本要求。药代动力学实验显示[18F]-THK523迅速从血液分布到其他组织器官(t1/2α= 47.92 min),并且在组织中有适中的保留时间(t1/2β= 965.10 min),符合房室模型,其方程式为Y= 2.23e-0.014t+1.89-00007t K12为0.0067 min-1,K21为0.0070 min-1, Ke为0.0015 min-1,血浆清除率(Plasma Clearance, CL)为0.0359 ID%g-1 min-1,药物浓度-时间曲线下面积(area under concentration-time curve, AUC)为2785.08 ID%g-1min。体内分布研究显示,正常小鼠生物分布实验显示[18F]-THK523给药后2 min具有较高进脑量,特别是海马区域,随后快速清除。[18F]-THK523急性毒性研究呈阴性。总而言之,[18F]-THK523小分子量,稳定性好,电中性、脂溶性的,并且不具备血浆蛋白浓度依赖性。前期研究显示,[18F]-THK523具有脑显像剂的优势,有望进一步研究。第三部分[11C]-PIB全自动合成及相关显像研究目的：为改善[11C]-PIB的自动化制备,提高其放化纯和比活度,减轻临床注射疼痛。应用PMOD软件对[11C]-PIB PET/MRI进行分析,探讨[11C]-PIB PET定量分析方法,为今后Tau蛋白显像的临床应用提供参考。方法：采用TRACER1ab FXc自动化模块,[11C]C02在Ni催化剂的作用下,于400℃高温反应,生成11CH4；11CH4与升华的碘在730℃高温下反应生成11CH3I;11CH3I与Ag-Triflate在190℃下反应生成11C-Triflate-CH3I;11C-Triflate-CH3I与前体6-OH-BTA-0反应生成[11C]6-OH-BTA-1,即[11C]-PIB.用半制备纯化后,对[11C]-PIB进行标准质量控制。收集临床诊断为aMCI的17例患者,行MRI和PET/CT检查,用PMOD软件对各个脑区进行分析。结果：采用新模块改进后自动化合成[11C]-PIB,其比活度、放射性浓度都得到明显改善,有利于临床应用,制备的[11C]-PIB澄清透明无沉淀,pH值为6.9-7.0,无菌滤膜通透性压力≥0.4 MPa,乙醇含量10%,RCP95%,放射性浓度为17.6 mCi/mL,放射性半衰期为20±2 min,比活度为4±0.3 Ci/μmol,细菌学及内毒素实验均为阴性,各项指标均符合SFDA颁布的《正电子放射性药物质量控制指导原则》。17例研究对象经过临床MMSE评分、AVLT延迟回忆、波士顿命名测验、连线测验B、动物言语流畅性测验、临床痴呆评分和Hachinski缺血评分综合分析,诊断为aMCI患者。行PET/MRI检查后,PMOD分析显示其中13例病人PET/MRI检查示额叶、顶叶、颞叶、枕叶、楔叶、海马、扣带回后部、脑干、丘脑、白质等有不同程度[11C]-PIB沉积,以额叶、顶叶、颞叶、枕叶、楔叶、扣带回后部最明显,4例这些区域无明显[11C]-PIB沉积。PMOD为脑部各脑区分析提供一种定量方法,[11C]-PIB PET检查显示临床诊断为aMCI的17例病例,其在aMCI筛选的阳性率为76.5%,进一步研究有待于今后随访确定。[11C]-PIB PET的临床方法学研究为今后Tau蛋白显像的临床应用提供方法学借鉴。第四部分新型Aβ和Tau分子探针[18F]-TKP的标记、标记条件优化及生物学特性研究目的：研制一种有效的分子影像探针[18F]-TKP可以体内定量分析Ap和Tau含量水平,以早期诊断和有效评价AD治疗效果。方法：制备[18F]-TKP的标准品和标记前体,进行结构鉴定和标准质量控制。应用Tracerlab FX N Pro全自动放射性合成模块探索[18F]-TKP的制备条件,分别比较一锅法和两锅法在制备[18F]-TKP上的优劣,完成[18F]-TKP标准质量控制,比较两种制备方法在[18F]-TKP标记产率、合成时间、比活度等的差别。采用MicroPET行C57鼠体内定量分析,并用SD大鼠行脑部PET/MRI检查,用PMOD软件进行分析,完成[18F]-TKP急性毒性研究。结果：大脑神经细胞内淀粉样蛋白和NFTS沉积的有效生物标记物在预测AD高位人群和准确评价正在研发的AD治疗药物至关重要。本课题研发了[18F]-TKP的前体、标准品,结构经过核磁和质谱鉴定,其总体产率分别为80%和70%以上,采用两种不同的放射性标记方法：一锅法和两锅法,并对总体合成时间、标记产率、比活度、产物放化纯、合成的自动化程度等进行比较,综合比较,选择两锅法。在产物纯化上,首先采用tC18 Sep-Pak Vac cartridge小柱除去无机和水溶性杂质,再用反相半制备液相进一步纯化,提取[18F]-TKP,然后将收集的[18F]-TKP再经tC18 Sep-Pak Vac cartridge进行固相萃取,纯[18F]-TKP用1 mL乙醇洗脱下来(tC18 Sep-Pak Vac cartridge对[18F]-TKP的捕获能力超过90%),所以用小体积的乙醇即可将[18F]-TKP洗脱下来。这有利于将[18F]-TKP制备成10%乙醇的注射液,仍然保持高比活度。[18F]-TKP质量控制符合SFDA颁布的《正电子放射性药物质量控制指导原则》。[18F]-TKP制备全程电脑控制,建立了[18F]-TKP自动化合成工艺路线,如此方案,保证了[18F]-TKP的高放化纯,为进一步动物实验及将来的临床研究提供了保证。这样的高浓度注射液在啮齿类动物实验中极为关键,如此才能保证小体积(250-500 mL)含有足够的放射性(1-3mCi)。[18F]-TKP将来在临床应用中也能得到保证,比如10%的乙醇[18F]-TKP溶液用25%人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)稀释后,能够保持有效的稳定性和溶解性。纯品[18F]-TKP用无菌滤膜(0.22mm)进行无菌处理,过滤后无菌滤膜上放射性残余极低(3-5%的[18F]-TKP放射性),HPLC分析显示[18F]-TKP的乙醇或生理盐水、人血清白蛋白溶液稳定性较好,可以保持6个小时以上。[18F]-TKP用一锅法和两锅法制备的放化产率、总体制备时间、比活度分别是18±3%(n=6)和25±5%(n=6),45-55 min和55-70 min,0.7±0.2 Ci/μmol和1.5 ± 0.2 Ci/μmol(衰减矫正到靶轰击结束)。[18F]-TKP是一种靶向研究淀粉样蛋白和Tau蛋白的潜在PET显像剂。用PMOD对PET/MRI图像进行分析,进脑量最高在注射[18F]-TKP后2min,大多数脑区的分布差不多,如杏仁核,尾壳核,皮层(皮层听觉皮质扣带,内嗅皮质,额叶皮质,大脑岛叶皮质,皮质内侧前额叶,皮质运动,皮层眶额叶,皮质躯体感觉,视觉皮层),海马,丘脑,嗅,中脑腹侧被盖区,腹侧被盖区,丘脑整体,垂体和脑桥等。[18F]-TKP随后被快速洗脱清除,[18F]-TKP注射后30 min达到平台期,随后有缓慢的上升,摄取最高的区域主要在嗅皮层,其次为垂体,杏仁核,下丘脑,脑桥腹侧被盖区,中脑,海马,皮质,尾壳核和丘脑的整体,嗅皮层洗脱最快,其次为海马和其他皮层区域。对于皮层而言,内嗅皮层摄取最高,清除最缓慢,其次为视觉皮层,大脑岛叶皮质,皮层眶额叶,皮质听觉,扣带皮质,额叶皮质,皮质内侧前额叶,运动皮层和皮层躯体感觉。[18F]-TKP主要通过肝脏代谢,小鼠急性毒性试验阴性。第五部分[11C]标记正电子放射性药物[11C]-TKF的核素标记条件优化及生物学特性研究目的：在前期实验的基础上,我们设计Tau蛋白的新型探针[11C]-TKF,并进行自动化工艺建立和临床前期研究。方法：合成[11C]-TKF的标准品CTKF,并进行结构鉴定和质量控制。采用’1C-CH3I和11C-Triflate-CH3I两种方法对[11C]-TKF的标记进行标记优化。完成[11C]-TKF的标准质量控制。完成[11C]-TKF在正常C57小鼠的体内分布和急性毒性研究。结果：成功合成[11C]-TKF的标准品CTKF,核磁结构鉴定吻合,质量控制无菌性和内毒素检查均为阴性,纯度高达99%。[11C]-TKF采用11CH3I和11C-Triflate-CH3I两种方法合成,都成功得到了[11C]-TKF,合成后的[11C]-TKF与标准品CTKF混合进样后,分析性HPLC显示紫外峰和放射峰都具有高度一致性,保留时间约5.5 min左右,尽管11C-Triflate-CH3I法在11CH3I与Ag-Triflate在190℃下反应生成11C-Triflate-CH3I时多用了5 min时间,11C-Triflate-CH3I法整个制备过程大概需要35-40min,但是合成产率和比活度远远高于11CH3I法。两种方法最后得到的[11C]-TKF注射液pH值接近中性,无菌滤膜通透性压力≥0.4 MPa,乙醇含量10%,细菌和内毒素均为阴性,整个质量控制符合SFDA颁布的《正电子放射性药物质量控制指导原则》。正常动物体内分布示[11C]-TKF主要通过胆道代谢,总体进脑量较[18F]-THK523理想,并且快速洗脱,急性毒性实验阴性。值得一提的是,有些参数必须通过体内给药得到,比如,一个理想是显像剂体内对NFTs的可视化在很大程度上取决于其通过血脑屏障的水平。[11C]-TKF通过血脑屏障的水平比较理想,并且可在正常动物脑内快速洗脱。
【关键词】：~(18)F标记 神经纤维缠结 β淀粉样蛋白 阿尔茨海默病 特异性分子探针 正电子发射计算机断层扫描 自动化放射性合成 化学动力学 生物学特性
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16;R817.4
【目录】：

• 缩略词索引5-8
• 中文摘要8-14
• ABSTRACT14-23
• 前言23-34
• 参考文献31-34
• 第一章 [~(18)F]-THK523的核素标记及标记条件优化34-56
• 1 实验材料35-37
• 2 实验方法37-45
• 3 结果与讨论45-54
• 4. 本章小结54-55
• 5. 参考文献55-56
• 第二章 [~(18)F]-THK523的生物学特性研究56-80
• 1 实验材料56-57
• 2 实验方法57-64
• 3 结果与讨论64-78
• 4 本章小结78
• 5 参考文献78-80
• 第三章 [~(11)C]-PIB全自动合成及相关显像研究80-102
• 1 实验材料81-82
• 2 实验方法82-87
• 3 结果与讨论87-99
• 4. 本章小结99-101
• 5. 参考文献101-102
• 第四章 新型Aβ和Tau分子探针[~(18)F]-TKP的标记、标记条件优化及生物学特性究102-145
• 1 实验材料103-106
• 2 实验方法106-118
• 3 结果与讨论118-140
• 4. 本章小结140-144
• 5. 参考文献144-145
• 第五章 [~(11)C]标记正电子放射性药物[~(11)C]-TKF的核素标记条件优化及生物学特性研究145-172
• 1 实验材料146-147
• 2 实验方法147-153
• 3 结果与讨论153-170
• 4. 本章小结170-172
• 综述172-186
• 参考文献181-186
• 博士期间发表论文和申请课题、专利186-187
• 博士期间参加学习培训、奖项187-188
• 致谢188-190

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 曹国宪;周杏琴;孔艳艳;张建康;钦晓峰;;NMDA受体显像剂~(99m)Tc-PQQ酯的药物动力学研究[J];核技术;2013年01期

2 王学斌,楚进锋;~(99)Tc~m放射性药物的分子设计(Ⅰ)[J];同位素;2003年01期

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本文编号：628868