胞外三磷酸腺苷在淀粉样蛋白β诱导的神经细胞损伤中的功能和机制研究

发布时间：2017-08-11 00:11

  本文关键词：胞外三磷酸腺苷在淀粉样蛋白β诱导的神经细胞损伤中的功能和机制研究

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【摘要】：阿尔茨海默症(Alzheimer's disease, AD)是一种神经系统退行性疾病,严重危害了中、老年人的生活质量,而随着全球老龄化的到来,其发病人数逐年增加,对社会所造成的危害也日益加剧。AD患者的记忆、认知、学习能力呈现渐进式的衰退且不可逆转,生活自理能力逐渐丧失,多数病人最终死于感染。AD的发生发展机制尚不明确,但淀粉样蛋白β(amyloid β, Aβ)在AD中的核心作用是受到广泛认同的。AD发生过程中,Ap过量表达,形成寡聚物以及不溶性的Ap纤维逐渐沉积为斑块,最终形成老年斑。大量的老年斑作为病灶,产生神经毒性,是AD的重要病理特征。然而,Aβ的神经毒性机制十分复杂,目前仍然无法完整解释。因此,Aβ细胞毒性机制一直是研究的热点,并且对于AD的诊断以及治疗具有重大意义。为探讨Aβ诱导神经损伤的分子机制,实验中采用Neuro-2a细胞和小鼠原代大脑皮层神经细胞建立了Aβ诱导神经细胞损伤的细胞模型,通过MTT细胞活性检测、显微镜下细胞形态观察、Hoechst荧光染色、TUNEL检测等多种方法,研究不同浓度Aβ25-35对于神经细胞活性与存活的影响。结果显示,Aβ25-35能够造成神经细胞细胞活性降低,表现为浓度依赖性。Aβ25-35能够引起N2a细胞形态改变,出现分化、变小、细胞破碎等现象；原代皮层神经细胞在Aβ的作用下出现突触断裂丢失,胞体变小、皱缩等细胞损伤表现,并且出现较多凋亡细胞。实验表明,Aβ25-35能够引起神经细胞的损伤。据报道神经系统损伤释放的核苷酸可能参与介导细胞的损伤,胞外核苷酸包括ATP、 ADP、UTP、UDP及其衍生物。为探究Aβ诱导的神经细胞损伤是否与胞外核苷酸有关,本文在细胞实验中先用胞外核酸酶Apyrase处理细胞后,再加入Aβ25-35刺激N2a细胞。发现Apyrase加入后,相对于Aβ25-35单独刺激组,Apyrase处理细胞的活性有所回升,说明胞外核苷酸可能参与了神经细胞损伤。我们进一步用不同浓度ATP、ADP、UTP、 UDP直接刺激N2a细胞,结果发现,只有3、5、10mmol/L等高浓度的ATP会引起N2a细胞活性显著的下降,并且存在浓度依赖。显微镜下细胞形态观察、Hoechst荧光染色、TUNEL检测的结果也证实了这个现象。随后我们利用生物素荧光法对Aβ25-35刺激N2a以及N9细胞上清中的ATP进行了检测,发现Aβ25-35能够引起N2a神经细胞和N9小胶质细胞释放ATP,并且具有时间依赖性。通过荧光定量PCR实验,我们发现Aβ25-35刺激N2a细胞后,作为ATP的受体P2X7表达上调。我们进一步利用P2X7受体抑制剂BBG预处理神经细胞,发现Aβ25-35及ATP引起的细胞损伤得到显著的缓解。说明胞外ATP是通过与P2X7受体结合,在Ap引起的神经细胞损伤中发挥作用的。最后,通过荧光定量PCR与蛋白免疫印迹实验,我们发现Aβ通过胞外ATP引起的神经损伤,在细胞内是通过激活BAX表达,并且引起Caspase-3激活以及剪切实现的。提示我们ATP诱导的细胞损伤可能是通过线粒体凋亡途径,引起Caspase-3激活而引起的。综上所述,Aβ25-35能够引起ATP释放,胞外ATP与神经细胞质膜上P2X7受体结合后,引起下游BAX、Caspase-3等凋亡相关蛋白激活,进而造成神经细胞损伤。而P2X7受体抑制剂BBG能够部分阻断Aβ25-35引起的神经损伤。本文为Aβ的细胞毒性机理研究提供了新的思路,也为P2X7受体作为AD治疗靶点的研究提供了理论基础。
【关键词】：阿尔兹海默症 淀粉样蛋白β 神经细胞损伤 三磷酸腺苷 P2X7受体
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一章 Aβ可以明显诱导神经细胞的损伤14-29
• 1 引言14-15
• 2 实验材料15-16
• 3 实验方法16-19
• 4 实验结果19-26
• 5 分析与讨论26-29
• 第二章 胞外ATP在Aβ诱导的神经细胞损伤发挥重要作用29-44
• 1 引言29-30
• 2 实验材料30
• 3 实验方法30-32
• 4 实验结果32-42
• 5 分析与讨论42-44
• 第三章 Aβ通过胞外ATP引起神经细胞损伤的信号通路44-71
• 1 引言44-45
• 2 实验材料45-46
• 3 实验方法46-50
• 4 实验结果50-68
• 5 分析与讨论68-71
• 全文总结71-73
• 综述73-80
• 1 阿尔兹海默症73-75
• 2 Aβ与阿尔兹海默症75-77
• 3 P2X7受体在阿尔兹海默症中的功能77-80
• 参考文献80-86
• 附录86-87
• 致谢87

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本文编号：653324