阿尔茨海默病突触线粒体质量控制机制的研究

发布时间：2017-08-14 00:16

  本文关键词：阿尔茨海默病突触线粒体质量控制机制的研究

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【摘要】：研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)又称老年性痴呆,是老年人群中最常见的神经退行性病变之一。绝大多数的AD病例为散发病例,通常隐袭起病,缓慢、进行性进展。随着全球范围的人口老龄化问题越来越严重,AD作为与年龄相关疾病,患病率日益增长。线粒体功能障碍是AD发生发展过程中非常重要的机制之一,其线粒体质量控制途径受损,包括线粒体动力学失衡、线粒体DNA损伤修复异常以及线粒体自噬异常等,是当前的研究热点。突触线粒体功能障碍是AD早期病变之一,参与AD的突触损伤机制。而这些改变都和与AD发展相关的p淀粉样蛋白沉积密不可分。从AD脑内发现异常聚集的突触线粒体以及线粒体自噬在异常线粒体移除中的重要作用中我们可以推论,AD相关的突触线粒体功能障碍可能与突触线粒体的线粒体质量控制途径受损有关。线粒体自噬是线粒体质量控制的重要环节之一,是指通过巨自噬作用选择性的将受损的线粒体清除掉的过程,是维持细胞内线粒体群体健康的一个非常重要的机制。线粒体自噬在进化中非常保守,特异性地只去除受损的线粒体,对线粒体质量控制进行调节。具体的线粒体自噬的机制目前还不明了,现有的研究发现PINK1/Parkin级联反应是神经细胞中诱导线粒体自噬的主要途径。研究表明,不管是在正常的神经元功能维持中,还是在神经系统疾病的发生发展中,PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在维持线粒体质量方面起着非常重要的作用,因此我们推论PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在AD相关的受损突触线粒体清除和大量功能异常线粒体聚集等病理机制中也起着至关重要的作用。AD脑内线粒体DNA拷贝数的改变引起了我们对AD脑内线粒体DNA质量控制相关蛋白研究的兴趣。A-SUCL-β蛋白是线粒体DNA质量控制途径相关蛋白,为琥珀酰辅酶A合成酶(Succinyl-CoA Ligase, SUCL)的p亚基之一。SUCL是三羧酸循环中的一个酶,存在于线粒体基质中,参与催化将琥珀酰辅酶A和ADP或GDP转化为琥珀酰、辅酶A和ATP或GTP的可逆性反应,它是一个异构二聚体,由一个固定的α亚基SUCL-a,和一个底物特异性的p亚基A-SUCL-β(由SUCLA2基因编码)或G-SUCL-P(由SUCLG2基因编码)组成,其中SUCL-a与A-SUCL-β结合可以合成ATP,与G-SUCL-β结合可以合成GTP。SUCLA2基因作为A-SUCL-p蛋白的编码基因,其缺失或突变均可以导致线粒体DNA的缺失从而导致各种线粒体脑肌病的病理表现。并且研究发现A-SUCL-β蛋白特异表达于成熟的神经元细胞中,在神经元发育过程中起着重要作用。研究表明,这类线粒体疾病的主要病理特征为线粒体DNA拷贝数的减少,而其原因大多都是因为SUCLA2基因的突变而导致琥珀酰辅酶A合成酶的活性降低所致。由于肌肉、脑、肝脏等器官耗能较高,所以线粒体DNA缺失主要表现为一组这些高耗能器官功能障碍等遗传异质性临床特征,包括进行性肌无力,脑病,心肌病,肝性脑病,通常伴有乳酸血症等。发病一般在一岁以内,许多病例病死于儿童期早期。基于AD中存在的线粒体DNA损伤及缺失,以及A-SUCL-β蛋白与神经元发育及线粒体DNA完整性的重要联系,我们推测A-SUCL-β蛋白也可能参与了AD的发生发展过程。然而在AD的发生机制中有关A-SUCL-β蛋白的数据目前还是空白。研究目的1、研究AD相关突触线粒体的功能障碍以及线粒体质量控制途径的损伤情况。2、研究A-SUCL-β蛋白参与AD突触线粒体质量控制的机制。研究方法1、动物模型：我们通过AD模型小鼠-5xFAD转基因小鼠及其同窝非转基因的对照组小鼠,每个杂交笼内均放有一只5xFAD转基因小鼠雄鼠与1到2只第一代背景鼠SJL雌鼠。实验用鼠均为杂交鼠第二代,理论上同窝出生的小鼠中5xFAD转基因小鼠和转基因阴性的对照组小鼠比例为1：1。幼鼠生长至3周龄即分出母笼,打耳标、剪尾,进行基因型鉴定。2、非连续密度梯度离心提纯小鼠大脑突触线粒体：所有步骤均在4-C或冰上进行。首先取出小鼠大脑皮层,加入5倍体积的线粒体分离液(mitochondrial isolation buffer, IB),在玻璃匀浆器内匀浆约10次,1300g离心5分钟。用IB稀释Percoll至三种浓度(15%,23%和40%,体积／体积比,各2mL),在超速离心管中建立三层非连续浓度梯度,将上清缓慢置于三层非连续浓度梯度的Percoll分离液之上。34000g离心14分钟。离心后,可见线粒体在离心管内被分为三层。第一层为细胞内破碎的膜结构。第二层(15%和23%Percoll之间)为突触小体,第三层(23%和40%Percoll之间为非突触线粒体。将第二层取出后,分别加入20mL含0.02%地高辛的1B,混匀后冰上静置5分钟,进一步破碎突触小体的膜结构释放出突触线粒体。16500g离心15分钟。取出沉淀,加入1mLIB重悬后再8000g离心10分钟。取出沉淀重悬后重复第2步非连续浓度梯度的Percoll离心。取出离心后第三层即为纯化的突触线粒体,加1B重悬后再清洗一遍,16500g15分钟、8000g 10分钟离心。沉淀即为突触线粒体。沉淀加入适量IB重悬线粒体后加入蛋白酶抑制剂,蛋白定量后用于实验或-80。C储存以备之后使用。3、Westernblot免疫印迹：将样本进行蛋白浓度测定,通过浓度体积计算后将各样本浓度调节至一致,加入已含还原剂p-ME的蛋白上样缓冲液后,混匀,沸水加热10分钟。将样本冷却至室温后,数秒离心将样本聚集至管底后混匀,按等体积上样至胶的加样孔内。电压120V电泳约1到2小时后,停止电泳。转膜所用PVDF膜使用前需甲醇预处理。转膜120V,90至100分钟(视目标蛋白大小而定)转膜结束后取出PVDF膜,室温干膜后用甲醇再处理至膜半透明状态。将膜放入封闭液中(TBS配置的5%脱脂牛奶),室温孵育1小时。按适当的比例用5%脱脂牛奶配置一抗,40C一抗孵育过夜。TBS室温洗三遍后,按适当的比例用5%脱脂牛奶配置二抗,室温二抗孵育1小时。TBS室温再洗三遍后,将膜置于ECL中显像,通过凝胶成像系统对信号进行采集,使用ImageJ进行条带处理及分析。4、新生小鼠大脑原代神经元培养：取出新生鼠大脑,在预冷的D-Hank's缓冲液中将大脑皮层分离出后去脑膜,分离出皮层或海马组织后,在新的含预冷D-Hank's缓冲液的离心管中再润洗一遍。皮层组织需要在分离后在预冷的培养皿中用刀片迅速切成细小的碎片。将预热至37℃的胰酶约等体积至两倍体积加入组织中,37℃水浴15分钟,每5分钟混匀一次。加入1mL胎牛血清终止胰酶反应。混匀后等组织沉至管底后将上清尽可能多的取出,加入相同体积的D-Hank's缓冲液,用吸管缓慢匀速吹打约20到30次,将消化好的组织吹散。将吹打混匀后的细胞悬液过筛后200g离心5分钟,去上清后,加入适量的培养液(Neurobasal A,2% B27,0.5mM左旋谷氨酰胺),细胞计数板计数后按所需密度种入已经包被好多聚赖氨酸的培养板中。培养中的原代神经元需约每3-4天换半液。5、线粒体DNA基因扩增：建立PCR体系(20μL体系,含0.4ug线粒体蛋白,一对引物各200nM, dNTP Taq DNA多聚酶,2μL 10X PCR缓冲液)；PCR循环(23个循环：94℃30秒,55℃ 30秒,72℃40秒)；扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳分离后EB染色显像。6、数据处理及统计学分析：Westernblot图像和PCR图像由BioRad公司ImageLab图像处理系统采集,由美国国家卫生院ImageJ软件进行条带灰度处理及分析,将目标蛋白灰度值以相应线粒体内参蛋白或细胞总蛋白内参蛋白调整处理后,将对照组数值设置为1,然后进行统计学分析。荧光免疫染色数据由尼康共聚焦显微镜自带图像分析软件采集并导出,数据分析通过ImageJ软件处理分析。数据统计学分析使用SPSS统计软件,通过两组间T-Test分析或多组间ANOVA方差分析,p0.05视为有统计学意义。所有数据均以平均数±标准差形式呈现。研究结果1、5xFAD转基因小鼠突触线粒体功能障碍的研究我们通过荧光免疫染色发现4月龄和8月龄5xFAD转基因小鼠的脑内均有Aβ沉积增多。并且我们将小鼠脑内突触线粒体提纯,通过Western blot免疫印迹及ELISA检测证实8月龄5xFAD转基因小鼠突触线粒体中有大量的Ap沉积,4月龄5xFAD转基因小鼠突触线粒体中Ap沉积不明显。通过4-HNE染色对脂类氧化进行检测发现在5xFAD转基因小鼠神经元中4-HNE染色显著增加,且有大量染色与胞体以及突起中的线粒体标记重合,提示神经元线粒体功能障碍和神经元内氧化应激增加相关。同时,mtDNA基因扩增数据显示,4月龄5xFAD转基因小鼠的突触线粒体中mtDNA拷贝数无明显变化；而8月龄5xFAD转基因小鼠的突触线粒体中mtDNA拷贝数比对照组明显降低(p=0.02)同时我们通过Western blot免疫印迹结果证实5xFAD转基因小鼠的突触线粒体动力学相关蛋白表达失衡。8月龄5xFAD转基因小鼠突触线粒体中的Mfn2表达量相比对照组显著降低(p0.01)；同样,OPA1表达量也显著降低(p=0.005),而5xFAD转基因小鼠突触线粒体中的Dlpl表达量相比对照组显著升高(p=0.001),均有统计学意义。2、5xFAD转基因小鼠突触线粒体自噬途径功能障碍的研究研究结果显示,8月龄的5xFAD转基因小鼠有大量的Parkin易位到突触线粒体上,而其对照组突触线粒体中Parkin水平则很低(p0.001)。然而两组之间大脑皮层匀浆中Parkin总表达量没有明显的差异。突触线粒体上的PINK1含量和大脑皮层匀浆中总PINK1的含量两组间没有统计学差异。同时与对照组相比,8月龄5xFAD转基因小鼠的突触线粒体中的P62水平明显升高；然而在大脑皮层匀浆中的P62水平两组间没有显著差异。同样,5xFAD转基因小鼠突触线粒体中的LC3显著增加(p0.001),提示5xFAD转基因小鼠脑内更多的突触线粒体被LC3标记,线粒体自噬小体的形成增加。我们进一步通过5xFAD转基因小鼠及对照组小鼠大脑皮层切片的电镜扫描图片观察到,5xFAD转基因小鼠的神经元的突触部位有大量的包含着线粒体的囊状小体聚集,即线粒体自噬小体。提示AD突触线粒体的线粒体自噬小体形成增多,但移除受阻。3、5xFAD转基因小鼠突触线粒体中A-SUCL-β蛋白的相关研究我们发现与各自相应年龄的非转基因对照小鼠相比,4月龄的5xFAD转基因小鼠突触线粒体中A-SUCL-β蛋白含量降低,约25%(p=0.03)；8月龄的5xFAD转基因小鼠突触线粒体中A-SUCL-β蛋白含量也降低,约28%,有明显统计学差异(p=0.02)。提示在AD发病早期即有A-SUCL-β的改变。与4月龄的非转基因小鼠相比,8月龄非转基因小鼠突触线粒体中A-SUCL-β蛋白含量也有降低趋势,但无统计学差异(p=0.13),表明A-SUCL-β降低并不是仅年老所致。而4月龄和8月龄的5xFAD转基因小鼠大脑匀浆内的A-SUCL-β蛋白含量均无明显变化,表明5xFAD转基因小鼠脑内的A-SUCL-β蛋白含量降低是神经元特异的。4、A-SUCL-p表达下调与Ap毒性相关关系的研究我们使用Ap寡聚体处理非转基因C57小鼠的原代培养神经元,来建立Ap毒性神经元细胞模型。结果发现,与对照组相比,1州的Ap寡聚体处理后的原代培养神经元中A-SUCL-β表达量较对照组降低(p=0.003)。然而,单纯的H202处理后的神经元内A-SUCL-β表达量无明显变化,表明单纯氧化应激并不能导致神经元中A-SUCL-β表达量下调。5、SUCLA2敲除／敲入细胞模型线粒体功能障碍的研究我们使用293T细胞进行SUCLA2基因敲除(SUCLA2-KO)及SUCLA2基因敲入(SUCLA2-KI)两种基因修饰。Western blot数据结果显示,与对照组细胞相比,SUCLA2-KO和SUCLA2-KI细胞中的OPA1的表达量均有不同程度的升高,约2到3倍,有统计学意义(p0.05)；而Mfn2表达量无明显变化。另外,SUCLA2-KO和SUCLA2-KI细胞中的D1pl都比对照组高,1.5倍左右,均有统计学意义(p0.05)另外我们也检测了Parkin诱导线粒体自噬途径相关蛋白的表达量,如Parkin、 PINK1、LC3等。结果显示,SUCLA2-KO和SUCLA2-KI细胞中的Parkin表达量均比对照组高,约1.6到1.8倍；与此相反的是与对照组细胞相比,SUCLA2-KO和SUCLA2-KI细胞中的PINK表达量却明显降低。SUCLA2-KO细胞中的LC3表达量比对照组高3倍多,SUCLA2-KI细胞中的LC3表达量比对照组高2倍,均有统计学意义(p0.05)。结论1、Parkin介导的线粒体自噬途径受损是AD突触线粒体质量控制非常重要的环节,其中AD突触线粒体自噬被强烈地活化,然而线粒体自噬小体的移除受阻可能更多地参与了AD相关的突触线粒体功能障碍的病理发展过程。2、A-SUCL-β在AD突触线粒体中含量降低,与突触线粒体中Aβ沉积相关,且在突触线粒体质量控制功能障碍中起重要作用。3、我们的研究数据进一步阐述了AD突触线粒体质量控制途径受损的机制,提示了线粒体质量控制的调节将是未来潜在的AD治疗新靶点。
【关键词】：阿尔茨海默病 突触线粒体 线粒体自噬 Parkin A-SUCL-β
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要8-14
• ABSTRACT14-20
• 符号说明20-22
• 中文版学位论文22-92
• 前言22-32
• 1、线粒体结构与功能22-23
• 2、阿尔茨海默病及其线粒体病理机制23-27
• 3、阿尔茨海默病的突触线粒体功能障碍与线粒体质量控制27-30
• 4、线粒体DNA缺失与琥珀酰胺A合成酶30-32
• 材料和方法32-41
• 1、主要仪器32-33
• 2、动物模型的培养与杂交33
• 3、试验方法及相关试剂33-40
• 4、数据统计学分析40-41
• 研究结果41-49
• 1、5xFAD转基因小鼠突触线粒体功能障碍的研究41-43
• 2、5xFAD转基因小鼠突触线粒体自噬途径功能障碍的研究43-45
• 3、5xFAD转基因小鼠突触线粒体中A-SUCL-β蛋白的相关研究45-46
• 4、5xFAD转基因小鼠原代培养神经元中A-SUCL-β蛋白的研究46
• 5、A-SUCL-β表达量的下降与Aβ毒性相关关系的研究46-47
• 6、SUCLA2基因敲除/敲入细胞模型线粒体功能障碍的研究47-49
• 讨论49-56
• 结论56-58
• 附图58-75
• 参考文献75-84
• 综述84-92
• 参考文献89-92
• 英文版学位论文92-154
• Introduction92-104
• 1.1 The structure and function of mitochondria92-94
• 1.2 Alzhdmer's disease and its mitochondrial pathogenesis94-98
• 1.3 Mitochondrial dysfunction and quality control of AD98-102
• 1.4 Mitochondrial DNA depletion syndrome and succinyl-CoA synthetase102-104
• Materials and Methods104-112
• 1. Equipments104-105
• 2. Breeding of 5xFAD transgenic mice105
• 3. Protocols105-112
• Results112-119
• 1. Synaptic mitochondrial dysfunction in 5xFAD transgenic mice.112-114
• 2. Dysfunction of mitophagy pathway in AD synaptic mitochondria114-116
• 3. Less A-SUCL-P in synaptic mitochondda of SxFAD transgenic mice116
• 4. Less A-SUCL-p in primary cultured neurons of SxFAD transgenic mice116-117
• 5. The association between A-SUCLr-β and Ap toxicity117-118
• 6. Research about SUCLA2 KO/KI293T cells118-119
• Discussion119-126
• Conclusion126-128
• Figures128-145
• Reference145-154
• 致谢154-155
• 攻读学位期间发表的学术论文155-156
• 附录156-174
• 学位论文评阅及答辩情况表174

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本文编号：669768