AD患者血浆长链非编码RNA BACE1-AS的提取及测序分析

发布时间：2017-08-18 01:05

  本文关键词：AD患者血浆长链非编码RNA BACE1-AS的提取及测序分析

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【摘要】：2011年,美国国家老龄化研究所和阿尔茨海默病学会(NIA-AA)发布AD新的临床诊断指南,对阿尔茨海默病痴呆、痴呆前有症状阶段及临床前无症状阶段分别提出了相应的诊断标准,强调研究Aβ作为生物学标志物对诊断的重要意义。但目前无论脑脊液还是PET检测Aβ,在临床常规开展仍存在困难。寻找新的血浆相关生物学标志物,特别是分子生物学水平的标志物,为AD的早期临床诊断和治疗提供依据是研究的热点。近年来,长链非编码RNA在疾病发生发展中的重要性不断被研究者揭示,研究发现了一些与AD相关的lnc RNA,通过文献回顾,我们发现BACE1-AS是其中最重要的发现。众所周知,Aβ的异常沉积是AD发病机制中的关键。而Aβ是由β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)在β-分泌酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE)和γ-分泌酶的先后作用下形成的。BACE1的反义链转录形成的长链非编码RNA BACE1-AS可与BACE1 m RNA形成双链结构复合物,避免了BACE1 m RNA被核酸酶降解,增加其稳定性,从而导致更多的Aβ沉积在脑组织。然而产生的Aβ又可作为细胞因子促进BACE1-AS的表达上调,从而实现了Aβ生成的正反馈调节机制,加速了AD病程的进展。有研究表明BACE1-AS在AD患者脑内高特异性高转录,但在患者血浆中的转录情况尚未见研究报道。本研究拟应用异硫氰酸胍-酚氯仿技术,提取中国汉族人AD患者血浆中BACE1-AS,通过测序分析验证其与国际报道序列的一致性,分析该lnc RNA在AD发生发展中的作用,为BACE1-AS作为AD治疗新靶点及血浆分子标志物提供研究基础。本研究以吉林大学第一医院神经内科门诊及住院部收治的临床可能AD患者和健康体检中心收集的性别、年龄及学历等相匹配的健康人为研究对象,共55例。入组者签署知情同意书后,并进行了血液样本的收集。随后采用异硫氰酸胍-酚氯仿法对血浆样本进行RNA提取;应用Primer Premier5.0软件设计引物;对提取的RNA进行逆转录;对逆转录成功的目的基因进行PCR扩增及凝胶电泳成像;基因测序分析;采用Chromas图像分析软件对比分析测序序列与genebank序列的一致性;通过统计学分析目的基因在两组间转录情况的差异。结果:基因测序结果通过美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)中BLAST进行比对后,证实与目的基因BACE1-AS完全一致。且测序结果显示,AD组中成功提取目的基因5例,达到18.52%。对照组成功提取目的基因0例,占0%。两组比较存在显著性差异(P0.05)。结论:AD患者血浆中存在lnc RNA BACE1-AS,且lnc RNA可以稳定存在于血浆中。AD组与对照组间存在显著性差异,佐证BACE1-AS与AD密切相关,且其特异性较高。为BACE1-AS作为诊断AD的生物学标志物提供理论依据。本研究创新点:首次对AD患者血浆中长链非编码RNA BACE1-AS的转录情况进行检测,并进行了测序分析,目前国内外尚无报道。
【关键词】：阿尔茨海默病 长链非编码RNA β分泌酶1反义转录物 血浆 生物学标志物
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 前言4-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 英文缩略词表13-14
• 第1章 引言14-16
• 第2章 文献综述16-28
• 2.1 AD的研究简介16-20
• 2.1.1 AD的流行病学及发病机制16-18
• 2.1.2 AD的诊断标准18-20
• 2.2 lnc RNA概述20-24
• 2.2.1 lnc RNA的研究发现及其特性20-21
• 2.2.2 lnc RNA的分类及调控机制21-23
• 2.2.3 lnc RNA与神经系统23-24
• 2.3 lnc RNA与AD24-27
• 2.3.1 BACE1-AS24-25
• 2.3.2 BC20025
• 2.3.3 ANT-Radl825-26
• 2.3.4 Apo E-ASl26-27
• 2.4 本章小结27-28
• 第3章 AD患者血浆长链非编码RNA BACE1-AS的提取及测序分析28-40
• 3.1 实验材料28-30
• 3.1.1 阿尔茨海默病的血浆标本28-29
• 3.1.2 试剂及来源29
• 3.1.3 实验室所需的主要仪器及设备29-30
• 3.2 实验方法30-36
• 3.2.1 AD血浆RNA的提取30-31
• 3.2.2 引物的设计与合成31-32
• 3.2.3 RNA逆转录合成c DNA32-33
• 3.2.4 PCR反应33-35
• 3.2.5 PCR产物的电泳35
• 3.2.6 基因测序35
• 3.2.7 统计学分析35-36
• 3.3 结果36-40
• 3.3.1 PCR产物电泳结果36
• 3.3.2 基因测序结果与分析36-38
• 3.3.3 目的基因提取结果38-40
• 第4章 讨论40-44
• 第5章 结论44-45
• 参考文献45-50
• 附录50-54
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果54-55
• 致谢55

【参考文献】

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