针对老年痴呆中Aβ42靶点的单链抗体及其分子机制的研究

发布时间：2017-08-19 10:24

  本文关键词：针对老年痴呆中Aβ42靶点的单链抗体及其分子机制的研究

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【摘要】：阿尔茨海默氏症（Alzheimer’s disease, AD）是一种神经退行性疾病，其病理特征是渐进性的Aβ42的聚集与沉积、神经突触丢失和神经纤维缠结，临床表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍。对于AD的发病机理有多种观点，其中普遍认同的是Aβ42毒性学说。现已证明，由β-淀粉样肽（Aβ42）单体聚集形成的Aβ42寡聚体是引起AD的主要致病因子。 有关AD的被动免疫治疗报道中，多数采用的是人源化的多克隆抗体或单克隆抗体，但这些抗体因分子大不易穿过血脑屏障或特异性差易引起副作用而限制了在临床上的应用。为克服这些限制，从构建小分子人源性抗体或抗体片段出发，筛选特异性识别和结合Aβ42寡聚体的单链抗体成为目前诊断或治疗AD的热点。 本论文利用分子生物学和细胞生物学等方法，通过β-淀粉样肽（Aβ42）抗原的构象设计和组装，利用Aβ42寡聚体为抗原特异性筛选，获得抗Aβ42寡聚体的单链抗体（scFv）基因，并表达出该单链抗体。所获得的单链抗体具有Aβ42寡聚体构象靶向性高、分子小、易实现脑转运等突出特点，并显示出了用于治疗和预防老年痴呆症（或称阿尔茨海默氏病，Alzheimer’s disease, AD）的有效性和可行性：（1）分离提取人外周血淋巴细胞，获得外周血淋巴细胞RNA并反转录合成cDNA。采用PCR扩增方法从人外周血淋巴细胞cDNA中获得重链可变区VH及轻链可变区VL，进一步以SOE-PCR方法获得scFv基因。以pET41b为载体，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建单链抗体库。（2）利用Aβ42寡聚体作为抗原筛选阳性克隆，最后获得了四株与抗原有较强结合的阳性克隆。对筛选出的阳性克隆进行序列测定，将所测得的scFv基因序列与GeneBank中的免疫球蛋白基因序列进行比对分析，分析结果显示所获得的四个克隆均为编码scFv的DNA序列，分别包含了编码抗体重链可变区（VH）、轻链可变区（VL）的DNA序列。（3）通过Dot-blot及Western blot方法，证明了获得的单链抗体能够特异性识别Aβ42寡聚体。（4）通过间接ELISA方法，测定单链抗体对Aβ42寡聚体的结合力。结果显示，测得四种单链抗体均可在稀释度为0.625nM仍有结合能力，因此确定四种单链抗体均可在nM级别水平发挥作用。进一步检测了四种单链抗体的亲和力常数KD，由KD值可以看出，获得的单链抗体与Aβ42寡聚体具有较强的亲和力。（5）ThT-F方法和电子显微镜观察等实验方法分析得出获得的单链抗体能够抑制Aβ42的聚集或纤维化、并能够诱导Aβ42聚集体解聚。（6）通过MTT及LDH释放实验分析发现，四种单链抗体能够明显提高细胞存活率，并且其抑制Aβ42寡聚体对细胞的毒性作用呈浓度依赖性。然而，单链抗体对Aβ42单体及纤维抑制作用不显著。进一步分析单链抗体对Aβ42毒性作用的抑制和中和作用。结果显示，四种单链抗体均具有抑制及中和Aβ42寡聚体及原纤维对细胞的毒性作用。并且，四种单链抗体的抑制Aβ42寡聚体及原纤维毒性作用均显著于中和作用。（7）通过应用人脐静脉血管内皮细胞HUVEC及胶质瘤细胞C6进行共培养的方法，建立体外血脑屏障模型，，检测单链抗体跨血脑屏障得的转运效率。结果显示，四种单链抗体穿透血脑屏障随时间增长而增加，并且在60min后穿透率达到峰值并呈现稳定。 上述结果为设计和研制免疫预防与治疗老年痴呆（或称阿尔茨海默氏病，AD）的新型小分子抗体药物提供了依据并奠定了基础，作为临床诊断和AD治疗的免疫制剂具有广阔的应用前景。
【关键词】：阿尔茨海默病 β-淀粉样蛋白 单链抗体 神经毒性 血脑屏障
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 绪论13-29
• 1. 阿尔茨海默病13
• 2. 临床症状和神经病理学13-15
• 3. APP切割及Aβ形成15-16
• 4. Aβ聚集及神经毒性16-18
• 5. 遗传因子和风险因子18-20
• 6. 淀粉样蛋白级联假说20-21
• 7. AD 的诊断和治疗21
• 8. 构象依赖性抗体21-22
• 9. 治疗 AD 的 scFv22-29
• 9.1 人工scFv23-24
• 9.2 天然重链抗体24-25
• 9.3 scFv的脑转运机制25-29
• 第二章 人源性的单链抗体库的构建、鉴定及抗 Aβ42 寡聚体特异性单链抗体的筛选29-47
• 引言29
• 2.1 实验材料29-30
• 2.1.1 质粒载体与菌株29
• 2.1.2 工具酶及主要试剂29-30
• 2.1.3 主要仪器30
• 2.2 方法30-40
• 2.2.1 外周血淋巴细胞 RNA 提取及反转录合成 cDNA30-31
• 2.2.2 编码 VH 与 VL 的 DNA 片段扩增31-32
• 2.2.3 编码 scFv 的 DNA 片段的拼接和扩增32-33
• 2.2.4 编码 scFv 的 DNA 片段与原核表达载体连接33-34
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）34
• 2.2.6 质粒的转化34
• 2.2.7 阳性克隆的筛选34-35
• 2.2.8 单链抗体基因的 DNA 序列测定35
• 2.2.9 单链抗体的诱导表达35
• 2.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）35-36
• 2.2.11 表达产物的纯化36
• 2.2.12 蛋白印迹（Western blotting）36-40
• 2.3 实验结果40-45
• 2.3.1 人源性单链抗体库的构建40-42
• 2.3.2 阳性克隆的筛选42-43
• 2.3.3 单链抗体的表达和制备43-45
• 本章小结45-47
• 第三章 抗 Aβ42 寡聚体特异性单链抗体的功能研究47-73
• 引言47
• 3.1 实验材料47-48
• 3.1.1 细胞株47
• 3.1.2 试剂47
• 3.1.3 主要仪器47-48
• 3.2 实验方法48-55
• 3.2.1 细胞培养48-50
• 3.2.2 Dot-blot 检测单链抗体与 Aβ42 寡聚体的结合特异性50
• 3.2.3 Western blot 检测单链抗体对 Aβ42 寡聚体的识别50
• 3.2.4 单链抗体对 Aβ42 寡聚体结合力的检测50-51
• 3.2.5 单链抗体亲和力常数的测定51-52
• 3.2.6 单链抗体对 Aβ42 聚集的抑制作用52
• 3.2.7 透射电镜观察单链抗体对 Aβ42 聚集过程及聚集体形态的变化的影响52
• 3.2.8 四唑盐（MTT）法检测单链抗体抑制 Aβ42 对细胞的毒性作用52-53
• 3.2.9 单链抗体对 Aβ42 细胞毒性的抑制和中和作用53
• 3.2.10 LDH 法检测单链抗体抑制 Aβ42 对细胞的毒性作用53-54
• 3.2.11 体外血脑屏障模型建立及单链抗体穿透血脑屏障的检测54-55
• 3.3 实验结果55-72
• 3.3.1 Dot-blot 检测四种单链抗体与 Aβ42 寡聚体的结合特异性的分析55
• 3.3.2 Western blot 检测单链抗体对 Aβ42 寡聚体识别的分析55-57
• 3.3.3 单链抗体对 Aβ42 寡聚体结合力的检测57
• 3.3.4 单链抗体亲和力的测定57-59
• 3.3.5 单链抗体对 Aβ42 聚集抑制作用的分析59-60
• 3.3.6 单链抗体对 Aβ42 聚集抑制作用的形态学分析60-61
• 3.3.7 单链抗体抑制 Aβ42 对细胞的毒性作用61-65
• 3.3.8 单链抗体对 Aβ42 细胞毒性的抑制和中和作用分析65-69
• 3.3.9 单链抗体抑制 Aβ42 毒性作用的细胞形态学分析69-70
• 3.3.10 单链抗体跨体外血脑屏障模型效应的分析70-72
• 本章小结72-73
• 讨论73-78
• 全文总结78-79
• 参考文献79-91
• 作者简介91
• 博士期间发表的学术论文及其他科研成果91-93
• 致谢93

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1 司进,朱荫昌,曹利民,王晓婷,梁幼生,管晓虹;抗弓形虫主要表面抗原1单链抗体的筛选及鉴定[J];中国血吸虫病防治杂志;2005年03期

2 程小峰;张佳锴;孟庆宇;黄小平;范鑫;庄国洪;;抗人死亡受体5单链抗体特性分析[J];免疫学杂志;2011年01期

3 秦海艳;毛晓燕;乔玉玲;李晓进;赵红;;单链抗体的研究进展[J];现代生物医学进展;2011年04期

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本文编号：700184