吗啡调节硫氧还蛋白表达的分子途径

发布时间：2017-08-22 12:03

  本文关键词：吗啡调节硫氧还蛋白表达的分子途径

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【摘要】：药物成瘾(Drug addiction)通常是指由于长期大量使用某种或多种精神活性药物而形成的一种慢性复发性脑病,其主要特征为机体出现强迫性用药、强迫性觅药,以及行为控制障碍等行为改变。 吗啡成瘾已成为困扰人类的世界性难题,然而其成瘾的机制尚不完全清楚。研究表明,吗啡可引起细胞内信号分子如细胞周期依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase5, CDK5)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein, CREB)及Ca2+相关分子等改变,这些分子在吗啡依赖形成及戒断综合征的产生中起十分重要的作用。CDK5是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,属于细胞周期依赖性蛋白激酶家族,但目前未发现其与细胞周期调控作用相关。在吗啡成瘾的研究中,CDK5可使吗啡受体的delta受体发生磷酸化,延缓了吗啡的耐受。CDK5还参与了成瘾过程中多巴胺信号的调节。CREB在药物成瘾中起着重要作用,是目前为止研究最深入的成瘾相关分子之一。CREB的第133位丝氨酸残基(Ser133)被磷酸化后就成为活性状态,即p-CREB。p-CREB可参与多种基因转录的调节,诱导细胞内的多种生物学效应。阿片类药物可以诱导p-CREB的产生,形成药物依赖。NR2B是N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体的一个亚基,在突触可塑性(Synaptic plasticity)和学习记忆过程中起着重要作用。NR2B高表达的转基因小鼠比普通小鼠表现出更强的学习记忆能力。药物成瘾的发生是一种病理性学习记忆的形成过程,因此,NR2B与成瘾密切相关。Ca2+是细胞内重要的第二信使,在吗啡成瘾中扮演着重要角色,使用钙离子通道阻滞剂可消除吗啡类药物依赖动物的戒断症状,长期接触吗啡类物质可使神经细胞膜中的钙离子通道增多。NMDA受体、钙/钙调蛋白依赖激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)及细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)是细胞内重要的Ca2+调控分子,在Ca2+的调节中发挥重要作用。 此外,吗啡成瘾还可导致氧化应激以及氧化还原平衡状态的失调。硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx)是一种能调节氧化还原状态的小分子蛋白质,其分子量约为12KDa,具有多种功能,广泛存在于原核、真核生物中。它与硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase, TrxR)、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)共同组成硫氧还蛋白系统,在机体内参与多种生理过程,发挥抗氧化、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖及调节基因转录等作用。因此,在本文中,我们选用NMDAR/CaMKⅡ/ERK通路的阻滞剂研究吗啡在PC12细胞中调节Trx的变化情况。 本研究中,我们采用低分化的PC12细胞为研究对象,探索吗啡对Trx作用的相关机理。结果发现,一定剂量的吗啡可以诱导细胞内Trx的表达。我们还发现NMDA受体的抑制剂MK-801, CaMKⅡ的抑制剂KN-62及ERK的抑制剂PD98059,可以阻断吗啡对Trx的诱导作用。此外,相同剂量的吗啡可抑制细胞内p-CREB的表达,而小鼠体内实验与细胞实验结果一致,高表达的Trx同样可以阻断吗啡引起的p-CREB表达的抑制。另外,吗啡可以抑制CDK5的表达。有趣的是Trx转基因小鼠海马区NR2B表达的升高。 总结：本课题研究了一定剂量的吗啡可以诱导Trx的表达并抑制CDK5和p-CREB的表达,NMDA受体的抑制剂MK-801, CaMKⅡ的抑制剂KN-62及ERK的抑制剂PD98059抑制吗啡诱导的Trx,初步阐明了吗啡诱导Trx表达的相关信号转导途径。高表达的Trx可阻断吗啡对p-CREB的抑制作用,并可诱导小鼠海马区NR2B的表达,提示Trx在吗啡成瘾中可能发挥一定的作用。因此,进一步研究吗啡与Trx的相关性,可能为药物成瘾的治疗提供新的理论依据。
【关键词】：吗啡 硫氧还蛋白 CDK5 CREB 药物成瘾
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.61
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• ~.略语索引14-16
• 第一章 绪论16-33
• 1.1 药物成瘾16-21
• 1.1.1 药物成瘾简介16
• 1.1.2 药物成瘾的机制16-20
• 1.1.3 吗啡20-21
• 1.2 硫氧还蛋白21-26
• 1.2.1 硫氧还蛋白简介21-22
• 1.2.2 硫氧还蛋白的生物学功能22-24
• 1.2.3 硫氧还蛋白与药物成瘾24-26
• 1.3 CDK526-28
• 1.3.1 CDK5简介26-27
• 1.3.2 CDK5与药物成瘾27-28
• 1.4 CREB/p-CREB28-29
• 1.4.1 CREB/p-CREB简介28-29
• 1.4.2 CREB/p-CREB与药物成瘾29
• 1.5 蛋白免疫印迹29-31
• 1.5.1 蛋白免疫印迹原理29-31
• 1.5.2 蛋白质免疫印记基本操作流程31
• 1.6 本论文研究的目的及意义31-33
• 第二章 吗啡对硫氧还蛋白表达的影响及其信号通路研究33-49
• 2.1 引言33-34
• 2.2 实验方案34
• 2.3 实验材料34-39
• 2.3.1 实验细胞及药物34
• 2.3.2 主要试剂34-36
• 2.3.3 主要仪器设备36-37
• 2.3.4 主要试剂的配制37-39
• 2.4 实验方法39-43
• 2.4.1 细胞培养39-40
• 2.4.2 细胞排板与药物刺激40
• 2.4.3 提取细胞总蛋白40-41
• 2.4.4 蛋白免疫印迹41-43
• 2.4.5 统计学处理43
• 2.5 实验结果43-46
• 2.5.1 吗啡对Trx最佳作用浓度的确定43-44
• 2.5.2 MK-801阻断了吗啡对硫氧还蛋白的诱导44-45
• 2.5.3 KN-62阻断了吗啡对硫氧还蛋白表达的诱导45-46
• 2.5.4 PD98059阻断了吗啡对硫氧还蛋白的诱导46
• 2.6 小结46-49
• 第三章 吗啡对CDK5表达的影响及其信号通路研究49-57
• 3.1 引言49-50
• 3.2 实验方案50-51
• 3.3 实验材料51
• 3.4 实验方法51-52
• 3.4.1 细胞培养51
• 3.4.2 细胞排板与药物刺激51-52
• 3.5 实验结果52-54
• 3.5.1 吗啡对PC12细胞内CDK5表达的影响52-53
• 3.5.2 MK-801阻断了吗啡对CDK5的抑制53
• 3.5.3 KN-62阻断了吗啡对CDK5的抑制53-54
• 3.5.4 PD98059阻断了吗啡对CDK5的抑制54
• 3.6 小结54-57
• 第四章 吗啡作用下Trx和p-CREB的相关性研究57-64
• 4.1 引言57
• 4.2 实验方案57-58
• 4.3 实验材料58
• 4.4 实验方法58-60
• 4.4.1 Trx高表达质粒的转染58-60
• 4.5 实验结果60-62
• 4.5.1 不同剂量吗啡作用下对CREB蛋白水平的影响60
• 4.5.2 不同剂量吗啡作用下对p-CREB蛋白水平的影响60-61
• 4.5.3 质粒转染后PC12细胞中Trx的表达情况61
• 4.5.4 Trx高表达PC12细胞中p-CREB的表达情况61-62
• 4.6 小结62-64
• 第五章 吗啡作用下Trx和NR2B的相关性研究64-72
• 5.1 引言64-65
• 5.2 实验方案65-66
• 5.3 实验材料66-67
• 5.3.1 实验动物及耗材66
• 5.3.2 CPP实验装置66-67
• 5.4 实验方法67-68
• 5.4.1 条件性位置偏爱实验67-68
• 5.4.2 小鼠脑组织的制备68
• 5.4.3 组织蛋白的提取68
• 5.5 实验结果68-70
• 5.5.1 CPP实验结果68-69
• 5.5.2 吗啡成瘾小鼠海马区NR2B蛋白的表达69
• 5.5.3 吗啡成瘾小鼠海马区p-CREB蛋白的表达69-70
• 5.6 小结70-72
• 第六章 结论72-74
• 6.1 确定了PC12细胞中吗啡诱导硫氧还蛋白表达的最佳作用剂量72
• 6.2 证明了PC12细胞中吗啡诱导硫氧还蛋白表达的信号转导通路72
• 6.3 证明了吗啡作用PC12细胞中CDK5表达的信号转导通路72
• 6.4 证明了吗啡作用下硫氧还蛋白及p-CREB的相关性72-73
• 6.5 初步证明了硫氧还蛋白在一定程度上参与了吗啡的成瘾记忆73-74
• 致谢74-75
• 参考文献75-81
• 附录81-89

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本文编号：719008