β-淀粉样蛋白42核酸适配体的筛选及其性质的考察

发布时间：2017-08-28 20:26

  本文关键词：β-淀粉样蛋白42核酸适配体的筛选及其性质的考察

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【摘要】：阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease，AD）是病因至今不明的神经退行性疾病，它的病理学特征是淀粉样斑块与神经纤维缠结。到目前为止，还没有找到根治AD的有效方法。-淀粉样蛋白（A）容易聚集形成淀粉样斑块沉积在大脑中，在AD的形成中具有非常关键的作用。A主要分为A和A，尽管在脑脊液中A含量比A42高几倍，但是，A42更容易积聚导致AD的产生；此外，脑脊液A42已经被确立为AD的生物标志物。因此，获得A特异性结合的配体对于AD诊疗技术的发展具有重要的意义。 核酸适配体作为一种新型分子识别元件，具有一些独特的优势，如靶标范围广、易于合成与修饰，稳定性好、亲和力高，特异性好等，从而使得它们在生物医药、临床治疗及生化传感等多个领域具有广阔的应用前景。A核酸适配体的缺乏在一定程度上制约了核酸适配体在AD诊断和防治方面的应用。为了有效促进AD诊疗的发展，筛选A的核酸适配体是非常有必要的。 本论文采用固定文库的筛选策略，以A42为靶标进行核酸适配体的筛选；并且对筛选得到的核酸适配体的性质进行了考察。研究内容主要包括： （1）A42核酸适配体的筛选 利用生物素化的反义链与DNA的杂交将ssDNA文库固定至链霉亲和素化的磁珠上，然后文库因与目标物结合发生构型变化而被从磁珠上洗脱至溶液中。通过简单快速的磁分离得到DNA-A42复合物。经过十轮筛选，得到富集度比较好的第七轮和第九轮文库，进行克隆测序并对测序结果进行分析，挑选出三条序列进行下一步的考察。 （2）A核酸适配体性质的考察 主要考察核酸适配体的亲和力和特异性。结果表明，三条待考察序列中有两条序列对A具有高亲和力和特异性，分别为A7-92和A9-103。然后为了使其更好地应用于实际工作中，对以上两条核酸适配体进行了序列优化，得到四条较短的能够特异性结合A42的序列。其中有一条优化链保持了与全长链相近的亲和力，，为A7-92-1。有趣的是，筛选和优化得到的序列都可以区分A和A，尽管A只是在C-末端比A多了两个氨基酸。此外，运用动态光散射和原子力显微镜考察了优化链A7-92-1对A42聚集的抑制效果。结果表明，A7-92-1对A42聚集具有一定程度的抑制作用。
【关键词】：阿尔兹海默症 β-淀粉样蛋白42 核酸适配体 SELEX
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 本文所用英文缩略词表10-11
• 第1章 绪论11-25
• 1.1 阿尔兹海默症的概述11-13
• 1.1.1 阿尔兹海默症的发展现状及危害11-12
• 1.1.2 阿尔兹海默症的病理学特征和致病机理12-13
• 1.2 淀粉样蛋白及其研究13-17
• 1.2.1 β-淀粉样蛋白的产生13-14
• 1.2.2 β-淀粉样蛋白的聚集及其毒性14-16
• 1.2.3 β-淀粉样蛋白 42 和 β-淀粉样蛋白16
• 1.2.4 β-淀粉样蛋白在阿尔兹海默症治疗和诊断中的作用16-17
• 1.3 β-淀粉样蛋白核酸适配体筛选的现状17-23
• 1.3.1 核酸适配体的特点及 SELEX 技术的发展17-20
• 1.3.2 β-淀粉样蛋白及阿尔兹海默症相关蛋白核酸适配体的筛选20-22
• 1.3.3 β-淀粉样蛋白核酸适配体在阿尔兹海默症诊疗中的应用前景22-23
• 1.4 本文拟开展的工作23-25
• 第2章 基于固定文库的 SELEX 技术筛选淀粉样蛋白 42 的核酸适配体25-43
• 2.1 前言25-26
• 2.2 实验部分26-33
• 2.2.1 实验试剂和仪器26-28
• 2.2.2 溶液的配制28-29
• 2.2.3 文库与引物的设计及质量鉴定29-30
• 2.2.4 PCR 退火温度的优化30
• 2.2.5 目标蛋白的预处理30
• 2.2.6 筛选过程30-32
• 2.2.7 文库结合率的考察32-33
• 2.2.8 克隆与测序33
• 2.2.9 序列分析及二级结构模拟33
• 2.3 结果与讨论33-42
• 2.3.1 文库与引物合成质量的鉴定33-34
• 2.3.2 PCR 条件的优化34-36
• 2.3.3 目标蛋白的处理和表征36-37
• 2.3.4 磁珠上 DNA 文库修饰效果的考察37-38
• 2.3.5 筛选文库结合率的监测38-39
• 2.3.6 测序结果及分析39-40
• 2.3.7 二级结构的模拟40-42
• 2.4 小结42-43
• 第3章 淀粉样蛋白 42 的核酸适配体性质的考察43-57
• 3.1 前言43
• 3.2 实验部分43-46
• 3.2.1 仪器和试剂43-44
• 3.2.2 序列亲和力的测定44-46
• 3.2.3 序列特异性的考察46
• 3.2.4 核酸适配体对β淀粉样蛋白 42 聚集抑制作用的考察46
• 3.3 结果与讨论46-56
• 3.3.1 序列亲和力测定结果46-48
• 3.3.2 序列特异性的考察结果48-49
• 3.3.3 核酸适配体的序列优化策略49-50
• 3.3.4 核酸适配体优化后序列亲和力和特异性的考察50-54
• 3.3.5 核酸适配体 Aβ7-92-1 对淀粉样蛋白 42 聚集抑制作用的初步考察54-56
• 3.4 小结56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-66
• 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录66-67
• 致谢67-68

【参考文献】

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1 王诗卉;淀粉样蛋白与茶多酚的分子相互作用[D];天津大学;2012年

本文编号：749291