CCK系统在创伤后应激障碍大鼠条件恐惧记忆中的作用及其机制研究

发布时间：2017-09-04 08:18

  本文关键词：CCK系统在创伤后应激障碍大鼠条件恐惧记忆中的作用及其机制研究

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【摘要】：创伤后应激障碍（Posttraumatic stress disorder，PTSD）是慢性的精神障碍性疾病，病因是由于遭受应激和创伤经历造成的，如家庭暴力、自然灾害或战争等相关的创伤。PTSD是以过度恐惧为特征的，并伴随敏感性增高，从而损害生活质量，并且引起多种疾病、社会和职业问题。目前，人们常把PTSD定义为焦虑障碍性疾病，但大量研究证明PTSD更适合归为学习和记忆障碍类的疾病，因为它包括恐惧记忆的过度巩固和消退的受损。恐惧反应的改变可能导致侵入性记忆和倒叙，增强了回避提示线索和自主觉醒症状。许多研究证明杏仁核是影响PTSD的关键核团。尤其是杏仁核基底外侧核（BLA）对于情感记忆的形成非常重要，在条件恐惧的获得和表达中起重要作用。所以，目前BLA在PTSD的研究中更受关注。 在过去的研究中，胆囊收缩素（Cholecystokinin, CCK）被认为是与学习记忆、焦虑和恐惧等脑高级活动有密切关系的神经肽类物质。CCK及其受体在大脑中广泛分布，如，皮质、海马和杏仁核等。过去的一些研究证实了在BLA内的神经元存在高浓度的CCK和CCK mRNA。杏仁核内的CCK阳性神经元对调节锥体神经元的兴奋性和突触的整合具有很强的作用。以往的研究证明激活BLA内的CCK受体可以损伤恐惧记忆的消退。动物模型和人类影像学研究证据表明PTSD的一个潜在机制就是突触可塑性的异常。而先前的研究也已表明CCK可以增强海马的长时程增强并且增强实验动物的空间记忆能力。所以我们有理由认为CCK系统与PTSD的形成机制密切相关。然而，BLA内的CCK系统对PTSD的形成机制的影响尚无深入研究。 过去的数据表明PTSD需要从病因研究入手，因为恐惧记忆的起始与巴普洛夫条件恐惧有相似的过程。因此我们建立了环境相关的条件恐惧模型作为PTSD的动物模型。在此模型的基础上我们进一步探讨了BLA内CCK系统在PTSD发生发展过程中的作用及机制，同时在细胞水平上明确CCK受体在引起PTSD相关症状后的相关信号转导机制。以期为临床治疗PTSD选择有效的靶点提供生物学依据。 第一部分创伤后应激障碍大鼠杏仁核内CCK系统及相关神经递质的变化 目的：以巴甫洛夫条件模型为基础建立与PTSD恐惧症状相关的动物模型；在此模型的基础上观察给予厌恶刺激后内源性CCK系统的变化，包括细胞外和细胞内CCK水平，以及CCK受体；同时也观察了给予厌恶刺激后其他相关的神经递质的变化，包括儿茶酚胺类神经递质及其代谢产物，HPA轴的相关递质，以及与学习记忆相关的神经递质。 方法：①建立PTSD的动物模型，通过大鼠对电流强度和电流时间的反应，确立合适的足底电击程序。最后确定为给予大鼠1.2mA的电流，每120秒给予一个60秒的电击，最后180秒自由活动，总共30min。所有的动物被随机分为5组：1天组、7天组、14天组、28天组和对照组；②应用微透析实验收集大鼠模型前及模型后1天和28天在BLA内的细胞外液；③应用高效液相色谱、液质联用和放射免疫技术，检测透析液内各神经递质（包括肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、5-HT及其代谢产物，皮质酮和CRH，以及谷氨酸、天冬氨酸和乙酰胆碱）的含量；④应用放射免疫、免疫荧光和免疫组织化学的方法分别观察透析液中CCK的含量，BLA内CCK中间神经元的数量，以及CCK受体的阳性表达。 结果：①通过大鼠对电流强度和电流时间的反应，我们确定在给予1.2mA电流强度，，10次60秒电击的这种刺激方式下，大鼠不能消退环境相关的恐惧记忆。②在给与大鼠共30min的足底电击程序（1.2mA的电流，每120秒给予一个60秒的电击，最后180秒自由活动）后，大鼠不动时间百分比（freezing%）可以从1天维持到28天并呈持续增长趋势。③BLA内的去甲肾上腺素、多巴胺在电击后1天的水平有所增高，而肾上腺素无明显变化。④BLA内细胞外液的CRH分别在电击后1天和28天均明显高于基础水平。⑤多巴胺的代谢产物DOPAC和HVA，以及5-HT及其代谢产物5-HIAA在大鼠电击前后的BLA内并没有明显变化。⑥谷氨酸、天冬氨酸和乙酰胆碱在电击后在BLA均有明显升高，并且一直伴随着环境相关的恐惧记忆从1天一直持续到28天。⑦电击后1天和28天的BLA细胞外液的CCK水平明显增加；双标的免疫荧光显示了在BLA内含有CCK的神经元在给予足底电击后CCK免疫活性明显比电击前增高；BLA神经元内CCK2受体免疫活性在电击后1天和28天均明显增加，而CCK1受体仅在28天有少量变化。 小结：本部分实验成功建立了一个与创伤经验后的联想恐惧有关的PTSD条件性恐惧大鼠模型。证明了应激相关神经递质参与了PTSD形成的起始。同时在条件恐惧的进展过程伴随着CCK及其受体的高水平表达，与此同时与学习记忆相关的神经递质参与了整个PTSD的发展过程。提示内源性CCK系统可能是通过影响恐惧记忆参与了PTSD的形成和发展。 第二部分CCK系统在条件性恐惧过程中的作用及其受体机制 目的：本部分实验进一步观察内源性CCK是否通过其受体影响了恐惧记忆的获得和表达，以及在该模型下是否改变了BLA内的突触结构可塑性，以明确内源性CCK系统在恐惧记忆的获得和巩固中的作用及机制。 方法：①应用在体RNAi技术，分别敲减CCK的1和2受体，观察条件性恐惧大鼠模型的恐惧记忆的获得和巩固。②进一步通过对RNAi的大鼠进行自发活动测试、高架十字迷宫测试及Morris水迷宫测试来判断其在自发活动、焦虑和空间学习记忆上有无变化。③应用高尔基染色的方法观察内源性CCK系统对条件性恐惧大鼠树突棘密度的影响。④应用电镜观察内源性CCK系统对条件性恐惧大鼠杏仁核BLA内突触超微结构的影响。⑤应用液质联用观察内源性CCK系统对条件性恐惧大鼠杏仁核BLA内谷氨酸、天冬氨酸和乙酰胆碱的影响。 结果：①CCK1R和CCK2R的siRNA在体干扰效率分别为65%和72%。最佳敲减时间为转染后3天，后续的所有实验均在转染siRNA后3天进行。CCK1R和CCK2R在体干扰后CCK1R和CCK2R的蛋白表达水平明显低于正常对照组，证明CCK受体敲减模型成功。②手术和转染试剂对正常大鼠运动能力和恐惧反应均无影响。③对正常大鼠和BLA内CCK受体基因敲减的大鼠进行条件恐惧实验，发现电击1天或28天后，BLA内CCK2受体敲减后的大鼠在足底电击后1天和28天时不动时间百分比明显降低，说明对BLA内CCK2受体基因敲减能导致大鼠恐惧记忆的巩固受损。同时发现电击后1小时的各组大鼠不动时间百分比无明显变化，以及每组足底电击时间内的每一次电击后的各组大鼠不动时间百分均无明显变化。说明BLA内CCK受体基因的敲减不影响恐惧记忆的获得。④BLA内CCK2受体基因的敲减对动物自发活动无影响；BLA内CCK2受体基因的敲减不能使动物产生焦虑行为；BLA内CCK2受体基因的敲减不能损害动物空间记忆。⑤双侧BLA内注射CCK2受体的siRNA后的大鼠BLA内的神经元与正常大鼠的神经元均排列整齐致密，细胞形态完整，边界清晰，尼氏小体丰富，胞核大而圆，核仁清晰，基本没有观察到神经损伤。⑥遭遇足底电击后大鼠BLA内的兴奋性神经递质尤其是Glu、Asp和Ach均有明显增加，但是仅有Glu和Asp能够在CCK2受体基因的敲减后有所下降。⑦在条件恐惧后28天，大鼠BLA内的树突棘密度和树突长度明显增加，但在BLA内CCK2受体基因敲减后进行条件性恐惧，BLA内的树突棘密度和树突长度与单纯电击组相比明显减少。⑧条件性恐惧对突触形态的影响：条件性恐惧后28天U型突触数量、突触后致密物的厚度及突触前膜囊泡的数量均能显著增加，但BLA内CCK2受体基因敲减后突触形态则无明显变化。 小结：本部分实验在第一部分实验建立的条件性恐惧大鼠模型的基础上，观察了CCK系统对大鼠条件性恐惧的影响。研究结果证实，BLA内的CCK2受体是影响条件性恐惧记忆巩固的关键环节，而且是通过改变BLA内突触的结构可塑性而发挥作用的。 第三部分CCK2受体参与条件性恐惧过程中恐惧记忆巩固的分子机制 目的：本部分研究在细胞水平通过激活原代杏仁核神经元上的CCK2受体，观察其下游信号转导机制，以明确CCK2受体参与条件性恐惧记忆巩固的机制。 方法：①培养大鼠原代杏仁核神经元，免疫细胞化学法对神经元进行鉴定，及对原代杏仁核神经元有无CCK及CCK2受体进行鉴定。②shRNA-CCK2R腺病毒载体的构建，及转染到原代杏仁核神经元，应用实时荧光定量PCR检测转染效率。③应用CCK受体的高效激动剂CCK-8激活原代杏仁核神经元的CCK2受体。④应用DiI染色法观察CCK2受体对原代杏仁核神经元树突棘的影响。⑤应用非放射性标记法PKA检测试剂盒，检测CCK2受体激活后对原代杏仁核神经元PKA活性的影响。⑥应用in cell western的方法检测CCK2受体对原代杏仁核神经元内CREB磷酸化的影响。⑦应用钙成像检测CCK2受体对原代杏仁核神经元细胞内Ca2+的影响。⑧应用western blot法检测CCK2受体对原代杏仁核神经元内CamkⅡ磷酸化和突触素的影响。⑨应用western blot和免疫荧光检测CCK2受体对原代杏仁核神经元内PSD95的影响。 结果：①用神经元特异性标记物MAP-2多克隆抗体标记神经元，结果显示神经元细胞纯度＞90%；激光共聚焦显微镜下显示，原代杏仁核神经元含有丰富的CCK2受体和CCK阳性表达。②pAD-CCK2R-shRNA构建成功，并且能够应用于原代神经元细胞，最佳MOI值为100时CCK2受体的干扰效率为71.4%。③CCK2受体激活后，原代杏仁核神经元树突的二级分支上的树突棘密度明显增高。④CCK2受体激活后通过使PKA活性升高进一步增加原代杏仁核神经元细胞内CREB磷酸化。⑤CCK2受体激活后能刺激原代杏仁核神经元细胞的内钙释放，而引起细胞内钙增多，从而引起CamkⅡ磷酸化水平增加。⑥CCK2受体激活能增加原代杏仁核神经元细胞内突触素和PSD95的表达从而影响杏仁核神经元突触结构可塑性的变化。 小结：本部分实验在体外通过培养大鼠的原代杏仁核神经元，探讨了CCK2受体引起杏仁核神经元突触重塑及结构可塑性的重要机制。CCK2受体可以通过激活cAMP PKA-CREB及Ga2+ CaMKⅡ-CREB信号转导通路介导PSD95和的突触素翻译增多从而使杏仁核树突棘结构改变。同时也可能由于CCK2受体介导的CaMKⅡThr-262位点的自身磷酸化引起杏仁核神经元突触后致密物质的变化，引起杏仁核神经元突触结构可塑性的改变。结论：本实验系统研究了CCK受体对创伤后应激障碍大鼠恐惧记忆的影响，并对其触发的BLA神经元突触结构可塑性的机制加以深入探讨，得出以下结论： 成功建立了一个与创伤经验后的联想恐惧有关的PTSD条件性恐惧大鼠模型，在此模型基础上证明了内源性的CCK系统可能是通过影响恐惧记忆参与了PTSD的形成和发展。并进一步证明杏仁核BLA内的CCK通过CCK2受体影响BLA内神经元的突触重塑及结构可塑性而促进了条件恐惧记忆的巩固，通过对其机制进行深入的探讨，为PTSD的病理生理学机制提供依据，为其临床治疗提供潜在的药物靶标。
【关键词】：创伤后应激障碍 条件恐惧 胆囊收缩素 杏仁核 突触可塑性 神经递质
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.5
【目录】：

• 摘要5-11
• ABSTRACT11-16
• 英文缩写16-18
• 引言18-22
• 第一部分 创伤应激障碍大鼠杏仁核内 CCK 系统及相关神经递质的变化22-59
• 前言22-23
• 材料与方法23-36
• 结果36-40
• 附图40-48
• 附表48-51
• 讨论51-54
• 小结54
• 参考文献54-59
• 第二部分 CCK 系统在条件性恐惧中的作用及其受体机制59-112
• 前言59-60
• 材料与方法60-81
• 结果81-86
• 附图86-103
• 附表103-105
• 讨论105-108
• 小结108-109
• 参考文献109-112
• 第三部分 CCK2 受体参与条件性恐惧过程中恐惧记忆巩固的分子机制112-155
• 前言112-113
• 材料与方法113-127
• 结果127-131
• 附图131-144
• 附表144-148
• 讨论148-151
• 小结151
• 参考文献151-155
• 结论155-156
• 综述 条件性恐惧和杏仁核内突触可塑性与创伤后应激障碍关系的研究156-182
• 参考文献165-182
• 致谢182-183
• 个人简历183-184

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 王丽;何涛;;胆囊收缩素受体及其信号转导研究进展[J];国际检验医学杂志;2006年04期

2 孙源泉;李莉;高峰强;;创伤后应激障碍的神经生化机制研究现状[J];实用医药杂志;2008年11期

3 朴素芬,庄惠歆,周岩,韩济生;大鼠伏核、杏仁核、中脑导水管周围灰质内的CCK受体为CCK-B型受体:受体放射自显影分析[J];神经解剖学杂志;1992年02期

4 安献丽;郑希耕;;创伤后应激障碍的动物模型及其神经生物学机制[J];心理科学进展;2008年03期

5 张黎明;张有志;李云峰;;创伤后应激障碍的神经生物学研究进展[J];中国药理学通报;2010年06期

本文编号：790374