人脐血间充质干细胞对糖尿病血管性痴呆大鼠的影响

发布时间：2017-09-05 17:33

  本文关键词：人脐血间充质干细胞对糖尿病血管性痴呆大鼠的影响

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【摘要】：第一部分人脐血间充质干细胞的分离、培养、鉴定和标记目的:研究人脐带血间充质干细胞体外分离、培养条件。方法选择剖腹产手术,取出胎儿后,将新生儿侧脐带结扎,用取血袋取脐带血,共取20份,使用CAPD-1复合抗凝剂抗凝。将脐血稀释后,6小时内采取Ficoll密度梯度离心法收集单个核细胞。分离的单个核细胞以106/ml的密度接种于培养基中,放于37°C、5%二氧化碳细胞培养箱中培养,贴壁细胞达80%时消化传代。流式细胞仪鉴定细胞。CM-Di I标记人脐血间充质干细胞。结果20份人脐带血有10份分离培养出HUCB-MSCs,成功率为50%。收集的单个核细胞接种于培养基后,24小时才开始有少部分细胞贴壁,贴壁的细胞开始增殖缓慢,5天后可见较多的细胞贴壁,4周左右能达到80%融合,以1:3比例进行传代,细胞形态逐渐呈长梭状和圆形。经传代扩增,有3份出现旋涡状排列的间充质样细胞,其余冷保持但和杨的圆形细胞及少量梭形细胞混杂。培养的第3代细胞经流式细胞仪鉴定表达了HUCB-MSCs抗原标记CD44,不表达造血细胞系表面标记CD34。结论人脐血可以分离培养出间充质干细胞。能力的影响第二部分人脐血间充质干细胞对糖尿病血管性痴呆大鼠学习记忆目的建立可复制的糖尿病血管性痴呆大鼠模型,探讨人脐血间充质干细胞对糖尿病血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响方法50只健康雄性Wistar大鼠随机选择40只,腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制作糖尿病模型,有30只大鼠造模成功。1周后2-VO制备血管性痴呆模型。存活的40只大鼠分为正常组(SHAM)、糖尿病(DM)组、血管性痴呆(DM+VD)组、人脐血间充质干细胞(HUCB-MSCs)组,每组10只。DM组仅分离出双侧颈总动脉但不结扎;HUCB-MSCs组先经颈总动脉注入HUCB-MSCs 2×106再结扎双侧颈总动脉;DM+VD组先经颈总动脉注入等量生理盐水再结扎双侧颈总动脉。HUCB-MSCs移植后4周进行Morris水迷宫实验,测试大鼠学习记忆能力的变化结果与SHAM组相比,其余各组大鼠平均逃避潜伏期延长,差异有统计学意义(P0.05);与DM+VD组比较,HUCB-MSCs组大鼠平均逃避潜伏期缩短,差异有统计学意义(P0.05)。与SHAM组相比,其余各组组大鼠穿越原平台象限次数下降,差异有统计学意义(P0.05);与DM+VD组比较,HUCB-MSCs组大鼠穿越原平台象限次数增多,差异有统计学意义(P0.05)。结论HUCB-MSCs经颈总动脉移植后能改善糖尿病血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。第三部分人脐血间充质干细胞对糖尿病血管性痴呆大鼠海马区Ch AT、神经细胞凋亡的影响目的研究人脐血间充质干细胞对糖尿病血管性痴呆大鼠海马区Ch AT和神经细胞凋亡的影响方法从健康雄性Wistar大鼠50只中随机选择40只,腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制作糖尿病模型,有30只大鼠造模成功。1周后2-VO制备血管性痴呆模型。40只大鼠分为正常组(SHAM)、糖尿病(DM)组、血管性痴呆(DM+VD)组、人脐血间充质干细胞(HUCB-MSCs)组,每组10只。DM组仅分离出双侧颈总动脉但不结扎;HUCB-MSCs组先经颈总动脉注入HUCB-MSCs 2×106再结扎双侧颈总动脉;DM+VD组先经颈总动脉注入等量生理盐水再结扎双侧颈总动脉。Morris水迷宫实验后,免疫组化法观察各组大鼠海马神经元胆碱乙酰转移酶(Ch AT)的变化。流式细胞仪检测各组大鼠海马组织神经细胞凋亡。免疫荧光观察CM-Di I标记的HUCB-MSCs是否能通过血脑屏障作用于大鼠脑组织中。结果荧光显微镜下发现在糖尿病血管性痴呆大鼠脑组织中可见CM-Di I标记的HUCB-MSCs,证明HUCB-MSCs能透过血脑屏障作用于大鼠脑组织。与SHAM组相比,其余各组大鼠海马Ch AT阳性神经细胞数量降低,差异有统计学意义(P0.05);与DM+VD组比较,HUCB-MSCs组大鼠海马Ch AT阳性神经细胞数量增多,差异有统计学意义(P0.05)。流式细胞仪检测大鼠海马神经细胞凋亡:与SHAM组相比,其余各组大鼠海马神经细胞凋亡增多,差异有统计学意义(P0.05);与DM+VD组比较,HUCB-MSCs组大鼠海马神经细胞凋亡减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论人脐血间充质干细胞能通过增加糖尿病血管性痴呆大鼠海马区Ch AT阳性神经元数量,抑制海马区神经细胞凋亡,来改善糖尿病血管性痴呆大鼠学习记忆能力。小结1、可从人脐血中分离培养出间充质干细胞。2、高糖高脂饮食加链脲佐菌素诱导糖尿病模型,2-VO制作血管性痴呆模型是一种可复制的糖尿病血管性痴呆模型。HUCB-MSCs经颈总动脉移植后可进入大鼠脑组织,能够改善糖尿病血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。3、HUCB-MSCs能使糖尿病血管性痴呆大鼠海马Ch AT阳性神经元数量显著增多,海马区神经细胞凋亡减少。
【关键词】：人脐血 间充质干细胞 血管性痴呆 移植 糖尿病 血管性痴呆 学习记忆能力 海马 胆碱乙酰转移酶 细胞凋亡
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R749.13
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 符号说明13-14
• 前言14
• 第一部分 人脐血间充质干细胞的分离、培养、鉴定和标记14-20
• （一）材料和方法14-17
• （二）结果17-18
• （三）结论18-19
• （四）讨论19-20
• 第二部分 人脐血间充质干细胞对糖尿病血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响20-30
• （一）材料和方法20-24
• （二）结果24-27
• （三）结论27
• （四）讨论27-30
• 第三部分 人脐血间充质干细胞移植后糖尿病血管性痴呆大鼠海马Ch AT、神经细胞凋亡的变化30-41
• （一）材料和方法30-34
• （二）结果34-37
• （三）结论37-38
• （四）讨论38-41
• 参考文献41-50
• 文献综述50-63
• 参考文献59-63
• 攻读学位期间的研究成果63-64
• 致谢64-66

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