β-淀粉样蛋白纤维结构的固体核磁共振研究

发布时间：2017-09-07 05:40

  本文关键词：β-淀粉样蛋白纤维结构的固体核磁共振研究

  更多相关文章： 阿尔兹海默症 β-淀粉样蛋白纤维 固体核磁共振 魔角旋转

【摘要】：阿尔兹海默症俗称老年痴呆症,其主要的病理特征是淀粉样蛋白斑和神经纤维结。淀粉样蛋白斑的主要成分是p-淀粉样蛋白质,其纤维化过程伴随着蛋白质与膜的相互作用,因此解析磷脂双层膜环境下的纤维结构对于β-淀粉样蛋白质的聚集机理,以及阿尔兹海默症病理病因的深层次认知具有重要的研究意义。 固体核磁共振技术可以在磷脂膜环境下解析淀粉样蛋白质的三维结构以及纤维化的动力学过程,近年来成为研究此类蛋白质分子结构的有力手段。 本研究运用原核表达技术在大肠杆菌细胞中表达出Aβ1-40蛋白,运用离子交换层析和凝胶过滤层析技术,成功制备出高纯度的Aβ1-40蛋白,进而在溶液环境和DMPC/DMPG磷脂双层膜环境下孵育出Aβ1-40蛋白纤维。结合电泳技术、圆二色光谱、ThT荧光光谱和电子显微镜对Ap蛋白的纤维化过程进行初步表征,其中圆二色光谱主要用于检测纤维化过程中蛋白质二级结构的变化；ThT荧光光谱用于监测蛋白质纤维化的动力学过程；电子显微镜可以直观地提供纤维的外貌形态信息。最终结合固体核磁共振魔角旋转技术,解析出DMPC/DMPG磷脂囊泡环境下具有原子分辨率的Aβ1-40的分子结构。 本论文提出的DMPC/DMPG磷脂环境下的Aβ1-40的三维结构是近年来第一个在磷脂囊泡中得到的具有高分辨率的结构。同时以溶液环境下的Aβ1-40的纤维化过程为参照,从膜的成分、带电荷情况、蛋白磷脂比例和纤维化过程中蛋白质的起始浓度四个方面分析讨论了膜对Aβ蛋白纤维化过程的影响。总之,我们不仅说明了蛋白磷脂相互作用是如何加速Ap的纤维化过程,影响Ap的分子结构,而且进一步证明了Ap纤维化过程的复杂性和分子结构的多样性。
【关键词】：阿尔兹海默症 β-淀粉样蛋白纤维 固体核磁共振 魔角旋转
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所）
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：O657.2;R749.16
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-6
• ABSTRACT6-7
• 目录7-10
• 第一章 引言10-23
• 1.1 阿尔兹海默症简介10-11
• 1.2 β-淀粉样蛋白质简介11-13
• 1.3 Aβ和细胞膜的相互作用13-15
• 1.3.1 阴离子型磷脂对Aβ与细胞膜相互作用的影响13-14
• 1.3.2 蛋白磷脂比例对Aβ与细胞膜相互作用的影响14
• 1.3.3 磷脂成分对Aβ与细胞膜相互作用的影响14-15
• 1.4 固体核磁共振解析淀粉样蛋白质的结构15-21
• 1.4.1 固体核磁共振技术的优势15-16
• 1.4.2 同位素标记策略16
• 1.4.3 Aβ寡聚体结构的固体核磁共振研究16-17
• 1.4.4 Aβ纤维结构的固体核磁共振研究17-21
• 1.5 本文的研究意义与研究内容21-23
• 第二章 原理与材料23-29
• 2.1 质粒构建23-24
• 2.2 蛋白质表达纯化24-25
• 2.2.1 离子交换层析24-25
• 2.2.2 凝胶过滤层析25
• 2.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳25
• 2.3 淀粉样蛋白纤维的检测25-27
• 2.3.1 圆二色光谱25-26
• 2.3.2 荧光光谱26-27
• 2.4 仪器和试剂27-29
• 第三章 Aβ_(1-40)纤维样品的制备与表征29-56
• 3.1 前言29
• 3.2 质粒构建29-33
• 3.2.1 引物设计与扩增29-30
• 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳30-31
• 3.2.3 PCR产物胶回收31
• 3.2.4 载体质粒提取31-32
• 3.2.5 双酶切与连接32-33
• 3.2.6 转化和重组子的筛选与鉴定33
• 3.3 表达纯化33-39
• 3.3.1 表达与优化33-35
• 3.3.2 蛋白质纯化35-38
• 3.3.3 标记蛋白的表达38-39
• 3.4 溶液环境中Aβ_(1-40)纤维样品的制备及初步表征39-43
• 3.4.1 纤维化前Aβ_(1-40)预处理39-41
• 3.4.2 Aβ_(1-40)蛋白纤维化进程摸索41
• 3.4.3 Aβ_(1-40)蛋白纤维PAGE41
• 3.4.4 圆二色光谱检测二级结构变化41-43
• 3.4.5 ThT荧光光谱监测纤维化进程43
• 3.4.6 TEM观察纤维外貌特征43
• 3.5 膜环境下Aβ_(1-40)纤维样品的制备及初步表征43-46
• 3.5.1 DMPC/DMPG混合型磷脂中Aβ_(1-40)纤维样品制备43-44
• 3.5.2 DMPC/DMPG混合型磷脂中Aβ_(1-40)纤维PAGE44
• 3.5.3 圆二色光谱检测二级结构变化44-45
• 3.5.4 ThT荧光光谱监测纤维化进程45-46
• 3.5.5 TEM观察纤维外貌特征46
• 3.6 膜对Aβ_(1-40)纤维化过程的影响46-55
• 3.6.1 磷脂膜环境对纤维化过程的影响46-50
• 3.6.2 蛋白磷脂比例对纤维化过程的影响50-53
• 3.6.3 磷脂膜所带负电荷对纤维化过程的影响53-54
• 3.6.4 蛋白起始浓度对纤维化过程的影响54-55
• 3.7 小结55-56
• 第四章 Aβ_(1-40)纤维的三维结构56-66
• 4.1 前言56
• 4.2 核磁共振样品的初步表征56-58
• 4.3 化学位移指认与二级结构预测58-62
• 4.3.1 DMPC/DMPG磷脂环境下Aβ_(1-40)纤维样品的二级结构58-59
• 4.3.2 溶液环境下Aβ_(1-40)纤维样品的二级结构59-61
• 4.3.3 二级结构对比61-62
• 4.4 距离约束测量62-63
• 4.5 三维结构计算63-64
• 4.6 小结64-66
• 第五章 总结与展望66-69
• 5.1 总结66
• 5.2 展望66-69
• 参考文献69-74
• 附录74-83
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果83

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本文编号：807735