氧化应激对N2a-swe细胞影响的定量蛋白质组学研究

发布时间：2017-09-14 19:35

  本文关键词：氧化应激对N2a-swe细胞影响的定量蛋白质组学研究

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【摘要】：阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种致死性神经退行性疾病,主要病理特征包括淀粉样β-蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)在神经细胞外聚集形成老年斑(senile plaque,SP)和Tau蛋白过度磷酸化在胞内所形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。AD患者脑中过表达的Aβ对神经细胞有多方面的影响包括引起钙代谢紊乱、炎症反应、离子通道异常和氧化应激等。但是,也有人认为Aβ只是AD发生的下游事件,它是AD的标志物而非其发生原因。因此,研究Aβ是否是AD的诱因以及其与AD和氧化应激的关系是深入理解阿尔茨海默症的发病机制的一个重要问题。N2a-swe细胞是转入人APP695基因到N2a细胞中形成稳定细胞株,过表达Aβ、磷酸化tau蛋白、β分泌酶、Apo E等相关蛋白。我们主要是研究Aβ的过表达与AD的关系。本研究首先探究了不同浓度过氧化氢对N2a-swe细胞的活性、ROS的生成及Aβ含量的影响,发现1m M的H2O2处理N2a-swe细胞3h后可对细胞的造成氧化损伤,但未明显增加ROS水平,而μM级的H2O2未对细胞活性产生明显的影响,并且低浓度的H2O2也没有增加N2a-swe细胞Aβ的表达,反而有减少其表达的趋势,但结果不具统计学意义。本研究还尝试将携带有白鳍鲨甲硫氨酸亚还原酶A(Msr A)的质粒瞬时转染入N2a-swe细胞,但未在转入细胞中鉴定到目的蛋白的表达。随后,我们尝试通过构建慢病毒表达甲硫氨酸亚砜还原酶A的N2a-swe稳转细胞株,虽然生物学实验验证了构建的N2a-swe稳转细胞株成功,但是在质谱水平同样未鉴定到白鳍鲨的Msr A,因此,未进行组学方面研究。为了阐明Aβ是否是阿尔兹海默症的直接发病因素,我们利用定量蛋白质组学i TRAQ技术研究了转入人APP695基因的N2a细胞(即N2a-swe细胞)的蛋白质表达差异,发现了一系列变化显著的蛋白质,包括:精氨琥珀酸合成酶、谷胱甘肽S-转移酶A4、二硫键异构酶、法尼焦磷酸合酶、S100A6蛋白、视黄酸结合蛋白1、血清白蛋白、神经细胞粘附分子1、Rab GDP解离抑制因子α、Complexin-1、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、线粒体载体蛋白1、NADH细胞色素b5还原酶1、NADH脱氢酶和钙单向转运体调节亚基等,这些蛋白质的功能涉及氧化应激、神经元功能和线粒体的能量代谢。其次,利用定量蛋白质组学i TRAQ技术研究了白藜芦醇(Resveratrol,RSV)处理N2a-swe细胞在蛋白组学上的变化。RSV是一种天然多酚类化合物,多存在于葡萄皮和葡萄酒中,RSV可以防止由氧化应激诱导的细胞损伤。我们利用白藜芦醇处理N2a-swe细胞探讨白藜芦醇是否对过表达Aβ所引起的氧化应激具有缓解作用,发现白藜芦醇上调了过氧化物酶体定位信号1受体、早老素相关菱形样蛋白、微管微丝交联因子等三种蛋白质的表达,表明还原剂白藜芦醇对缓解AD起到一定的积极作用,但与此同时,白藜芦醇会使磷酸甘油酸激酶和磷酸丙糖异构酶的表达下调,这两种酶都是糖酵解相关的酶,他们的下调会使得细胞的糖酵解途径受阻,而低效率的糖酵解是AD脑中的特征,因此,以上结果提示一味的降低生物体内氧化水平并不一定对延缓AD进程具有积极作用,而维持生物体的氧化还原平衡才是关键所在。最后,利用定量蛋白质组学i TRAQ技术研究了H2O2对N2a-swe细胞在蛋白组学上的变化,发现H2O2处理N2a-swe细胞引起的蛋白变化总数为要远远多于白藜芦醇,表明氧化剂对N2a-swe细胞的影响较大,其中组蛋白(Histone H2和Histone H4)的表达明显上调,而二磷酸核苷激酶、硫氧还蛋白、过氧化物酶、肽基-脯氨酰顺反异构酶、旁胸腺素和前胸腺素α等均下调,这些蛋白参与神经细胞相关功能、抗氧化功能和蛋白质折叠功能,表明H2O2可能是影响这些蛋白的表达对N2a-swe细胞造成损伤。在差异蛋白水平上分析不足以完全说明氧化应激对N2a-swe细胞的影响,我们利用GSVA通路富集法对鉴定到的所有的差异蛋白进行了通路分析,结果表明N2a-swe细胞高表达Aβ后并没有引起太多通路的变化,只有聚糖降解、溶酶体和II型糖尿病三个通路被抑制。白藜芦醇处理后N2a-swe细胞有脂肪酸降解、聚糖降解、鞘脂代谢、溶酶体4种通路被激活,而错配修复、TGF-β信号通路、河马信号等9种通路被抑制。H2O2处理N2a-swe细胞后影响非常明显,有19种通路被激活,41种通路被抑制,这可能与高浓度H2O2胁迫N2a-swe细胞对细胞造成了氧化损伤有关。值得注意的是,Alzheimer's disease、Parkinson's disease和Huntington's disease三种神经退行性疾病的通路均被激活,以上结果表明N2a-swe细胞转入APP695基因未激活AD通路,而氧化应激和Aβ的协同作用会激活AD通路。综上所述,Aβ的过表达不仅可以直接提高氧化应激水平,也影响神经元功能和能量代谢和钙信号传导,因此,本研究结果支持Aβ是阿尔兹海默症发病因素的观点。本研究还表明,氧化应激会加速AD的发病进程,而白藜芦醇处理N2a-swe细胞对缓解AD发生具有一定积极作用,但也可能产生不利影响,这可能与本研究使用的白藜芦醇剂量较大有关,同时,说明只有维持体内合适的氧化还原水平才能最有效延缓AD的发病进程。
【关键词】：阿尔茨海默症(AD) 白藜芦醇 过氧化氢 N2a-swe细胞 氧化应激 iTRAQ
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第1章 前言13-25
• 1.1 阿尔茨海默病的简介13-17
• 1.1.1 AD的病理特征13-14
• 1.1.2 AD的发生机制学说14-16
• 1.1.3 AD的预防和的治疗16-17
• 1.2 氧化应激与AD的关系17-21
• 1.2.1 AD中氧化应激的标志物18
• 1.2.2 AD中氧化应激的主要来源18-19
• 1.2.3 AD中的抗氧化机制19-20
• 1.2.4 白藜芦醇目前相关的研究进展20-21
• 1.3 N2a-swe细胞作为AD细胞模型相关的研究进展21-22
• 1.4 定量蛋白质组学22-23
• 1.5 本论文的主要内容及意义23-25
• 第2章 实验材料与方法25-36
• 2.1 实验材料25-27
• 2.1.1 实验所用细胞株25
• 2.1.2 生化试剂及相关的试剂盒25-26
• 2.1.3 实验主要仪器26-27
• 2.2 培养基及主要试剂的配制27-29
• 2.2.1 细胞培养基及相关溶液的配制27-28
• 2.2.2 SDS-PAGE电泳试剂的配制28
• 2.2.3 蛋白胶内酶解相关试剂的配制28
• 2.2.4 质谱分析相关试剂的配制28-29
• 2.3 实验方法29-36
• 2.3.1 细胞的准备与相关处理29
• 2.3.2 CCK-8 法测定N2a-swe细胞活性29-30
• 2.3.3 荧光显微镜观测N2a-swe细胞形态30
• 2.3.4 流式细胞仪测定N2a-swe细胞内ROS水平30-31
• 2.3.5 ELISA法测定N2a-swe细胞分泌到胞外的Aβ 水平31
• 2.3.6 蛋白定量31-32
• 2.3.7 胶内酶解32-33
• 2.3.8 蛋白样品的酶解步骤33-36
• 第3章 实验结果36-60
• 3.1 CCK-8 法测定N2a-swe细胞活性36
• 3.2 荧光显微镜观测H2O2处理N2a-swe细胞后的形态36-37
• 3.3 流式细胞仪测定N2a-swe细胞的ROS水平37-38
• 3.4 ELISA法测定N2a-swe细胞分泌到胞外Aβ 浓度38-39
• 3.5 构建鲨鱼甲硫氨酸亚风还原酶A高表达的慢病毒N2a-swe细胞株39-41
• 3.6 不同条件处理N2a-swe细胞后的定量蛋白组学的研究41-48
• 3.6.1 N2a-swe和N2a细胞的差异表达蛋白41-44
• 3.6.2 白藜芦醇处理N2a-swe细胞的差异表达蛋白44-45
• 3.6.3 H2O2处理N2a-swe细胞的差异表达蛋白45-47
• 3.6.4 白藜芦醇和H2O2处理N2a-swe细胞的趋势一致差异表达蛋白47-48
• 3.7 非标定量蛋白质组学对i TRAQ定量结果的验证48-60
• 第4章 讨论60-70
• 4.1 N2a-swe与N2a细胞差异表达蛋白的分析60-62
• 4.2 白藜芦醇处理N2a-swe与N2a-swe差异表达蛋白的分析62-63
• 4.3 H2O2处理N2a-swe与N2a-swe差异表达蛋白的分析63-64
• 4.4 白藜芦醇和H2O2引起N2a-swe表达差异蛋白的分析64-65
• 4.5 蛋白差异表达及通路富集65-70
• 第5章 结论70-72
• 参考文献72-81
• 致谢81-82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：851941