人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞移植改善阿尔茨海默病大鼠认知功能和减轻神经病理损伤
发布时间：2017-09-18 19:22
本文关键词：人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞移植改善阿尔茨海默病大鼠认知功能和减轻神经病理损伤
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【摘要】：目的：阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种退行性神经系统疾病，神经元胞外β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积和胞内神经纤维缠结（neurofibrillarytangles，NFT）为其主要病理特征，临床上主要表现为认知功能障碍。目前，AD尚无有效的治疗方法。人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）和人羊膜间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）具有良好神经生物学特性和免疫调节作用，为AD的细胞治疗提供了可能。本研究主要探讨hAECs和hAMSCs移植对AD大鼠模型的治疗效应及生物学原理，评价其孰优孰次，为临床选择更适合于治疗AD的供体细胞提供实验依据。 方法：①采用胰酶-胶原酶两步消化法从足月分娩的人羊膜组织中分离hAECs和hAMSCs,用流式细胞仪（Flow cytometry， FCM）和免疫细胞化学（Immunocytochemistry，IC）法进行表型鉴定。②SD大鼠双侧脑室注射脂多糖（LPS）复制AD大鼠模型。模型大鼠随机分为4组:模型组(n=12)、培养基对照组（n=12）、hAECs移植组（n=12）和hAMSCs移植组（n=12）。细胞移植组双侧海马注射10ul hAECs或hAMSCs细胞悬液（5×105个细胞），培养基组同途径注射等体积无血清L-DMEM培养基。同时设正常组作为平行对照。细胞移植后2W和4W，各组处死6只动物，取大脑和外周血进行病理学和免疫学检查。③细胞移植前后和大鼠处死前分别水迷宫试验检测大鼠空间辨别性学习记忆能力的改变。④HE染色观察皮层海马组织的病理改变，硫磺素S染色观察病变组织淀粉样蛋白沉积和NFT。⑤免疫组化染色观察Aβ42、Tau蛋白、Ach、CD68(小胶质细胞）的表达，并用Image-ProPlus6.0图像分析系统分析其阳性区积分光密度（IOD）值（反映目标检测物的相对表达量）。⑥流式细胞术（FCM）检测外周血CD4+IFN-γ（+Th1）、CD4+IL-4+（Th2）、CD4+IL-17+（Th17）和CD4+Foxp3+（Treg）T淋巴细胞亚群的变化。⑦流式微球芯片捕获技术（cytometric bead array, CBA）检测血清IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α和IFN-γ细胞因子含量变化。⑧免疫荧光染色检测hAECs和hAMSCs在大脑移植区的存活及分化。 结果：①P3hAECs不表达CD34、CD45、HLA-DR、CD80和CD86，表达CD44、CD49f、CD326（Ep-CAM）、E-cad、CD29和CD73及CK19，具有良好的上皮表型特性。P3hAMSCs不表达CD34、HLA-DR、CD19、CD14、CD45、CD80和CD86，表达CD73、CD44、CD29，CD105和CD90及波形蛋白，，具有典型的MSCs表型特征。②与正常组比较，模型组从第3天开始大鼠逃避潜伏期明显增加（P㩳0.01），跨越平台次数减少（P㩳0.05），表明有明显的空间探索性学习记忆障碍；细胞治疗后2周，与模型组和培养基组比较，两个细胞治疗组从第3天起逃避潜伏期明显缩短（均P㩳0.01），跨越平台次数明显增加（均P㩳0.05），接近于正常组（均P㩳0.05）；治疗后4周， hAECs原位移植组从第4天起逃避潜伏期明显缩短（P㩳0.05），而hAMSCs组与模型组和培养基组比较则无差别(均P㧐0.05)；与hAMSCs组比较，hAECs组逃避潜伏期明显减少（P㩳0.05）。③模型组和培养基组动物大脑皮质或海马区神经元明显减少，排列紊乱，空泡化，淀粉样斑块和NFT沉积明显；hAECs和hAMSCs移植组神经元增多，排列正常，未见空泡化，淀粉样斑块和NFT明显减少。④与模型组和培养基组比较，两个细胞治疗组Aβ42沉积均明显减少（P㩳0.01，P㩳0.05）、异常磷酸化的Tau蛋白均明显减少（P㩳0.01，P㩳0.05）、Ach水平升高（P㩳0.01，P㩳0.05）、CD68(小胶质细胞)表达上调（P㩳0.01，P㩳0.05）；hAECs组Aβ沉积和Tau蛋白的减少以及Ach和CD68上调较之hAMSCs更为显著（均P㩳0.01，P㩳0.05）。⑤与模型组和培养基组比较，细胞移植后2周，hAECs治疗组外周血Th1和Th17细胞百分比下降（P㩳0.05），而Th2细胞上调（P㩳0.05），Th1类细胞因子IL-2和IFN-γ水平下调（均P㩳0.05），Th2类细胞因子IL-4下调（P㩳0.05），hAMSCs组的免疫指标与模型组和培养基组比较没有变化（P㧐0.05）细胞亚群变化均没有统计学意义（P㧐0.05）。⑥移植后4周，动物大脑移植区均可见hAECs和hAMSCs，并表达神经元特异性核蛋白（NeuN）。 结论：hAECs和hAMSCs移植均可明显改善AD大鼠空间辨别性学习记忆能力和神经组织病理损伤，其机制与减轻Aβ沉积和Tau蛋白过度磷酸化有关。实验结果表明，相对于hAMSCs，hAECs作为神经退行疾病细胞治疗的供体细胞更具价值。
【关键词】：阿尔茨海默病 人羊膜间充质干细胞 人羊膜上皮细胞 β淀粉样蛋白 Tau蛋白 免疫调节 大鼠
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16
【目录】：
- 英文缩略词5-7
- 摘要7-9
- Abstract9-12
- 前言12-14
- 1 材料与方法14-23
- 2 结果23-36
- 3 讨论36-40
- 4 结论40-41
- 参考文献41-45
- 综述45-53
- 参考文献49-53
- 致谢53-54
- 作者简介54
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
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本文编号：877385
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