硒蛋白R干预阿尔兹海默症病理过程的新机制研究

发布时间：2017-09-18 22:24

  本文关键词：硒蛋白R干预阿尔兹海默症病理过程的新机制研究

  更多相关文章： 阿尔茨海默症(AD) 硒蛋白R(SelR) 金属铜离子 β-淀粉样蛋白(Aβ) 剪丝蛋白(cofilin) 肌动蛋白(actin)

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是导致老年人痴呆的主要原因,已成为当前发病率最高的神经系统退行性疾病之一。临床上表现为记忆、认知以及行为障碍,其典型病理特征包括淀粉样蛋白(Aβ)在神经细胞外聚集形成老年斑(senile plaque,SP)和Tau蛋白过度磷酸化后在胞内形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)。此外人们发现氧化应激、神经元缺失及金属离子内稳态失衡均与AD的发生发展密切相关。在AD患者脑组织中,含有大量的过渡金属离子包括铜、铁、锌离子等。研究表明,这些金属离子促进Aβ的聚集和活性氧自由基(ROS)的生成,进而导致神经元缺失等多种细胞功能的损伤。因此认为:由金属离子诱导的Aβ聚集和细胞毒性是导致AD形成的重要原因之一。另一方面,在AD病人的大脑额皮质和海马中发现了剪丝蛋白-肌动蛋白(cofilin-actin)的棒状结构,而在正常的人脑组织中未发现此结构,其形成与神经退行性疾病发生有重要联系。这说明AD的发生可能与cofilin功能异常所引起的肌动蛋白结构改变有关。硒蛋白R是25种人类硒蛋白中的一种,含有第21种必需氨基酸—硒代半胱氨酸(Sec),是一种蛋氨酸亚砜还原酶,能立体专一性催化还原蛋白质中的R型蛋氨酸亚砜。因此,Sel R是一种有着特殊功能的硒蛋白,它具有活泼的氧化还原性质,并且参与到修复氧化损伤蛋白的过程中。本课题组前期研究工作发现:Sel R对Aβ聚集和tau蛋白过度磷酸化均有干预作用。在此基础上,本论文进一步在体外研究了Sel R与金属铜离子的结合性质及对Aβ聚集和细胞生长的影响。另一方面研究了Sel R与Rho A/ROCK通路的关系。研究结果表明:Sel R可与Cu+特异性螯合剂BCA竞争结合Cu+,说明Sel R具有较强的Cu+结合能力。通过Th T荧光实验,发现Cu2+/Cu+显著抑制Aβ42的纤维化、诱导其形成非纤维化聚集体,而Sel R则能够显著抑制Cu2+/Cu+诱导的Aβ42聚集形态的改变;通过细胞CCK-8实验,发现Sel R能显著降低Cu2+/Cu+诱导的Aβ42的细胞毒性。对三转基因AD小鼠脑部海马组织中蛋白表达水平进行检测,结果显示:与野生型小鼠相比,Sel R的表达量明显下降,而Rho A/ROCK通路相关蛋白Rho A、ROCK1和p-cofilin都明显升高;同时在N2A细胞系中,当Sel R敲低时,Rho A、ROCK1和p-cofilin也明显升高。说明Sel R也可以通过影响Rho A/ROCK通路来影响神经细胞发育,从而干预AD的发生发展。综上所述,本实验证明了Sel R一方面可以通过竞争性结合Cu2+/Cu+来抑制金属离子诱导的Aβ42聚集以及细胞毒性。另一方面也可以通过作用于Rho A/ROCK通路,调节肌动蛋白的装配,抑制神经元的突触损伤。本文从金属离子及神经发育的角度,研究了Sel R干预AD发生发展的新机制。
【关键词】：阿尔茨海默症(AD) 硒蛋白R(SelR) 金属铜离子 β-淀粉样蛋白(Aβ) 剪丝蛋白(cofilin) 肌动蛋白(actin)
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 文献综述10-23
• 1.1 阿尔茨海默病概述10-15
• 1.1.1 AD发病机制概述10
• 1.1.2 Aβ 级联学说10-11
• 1.1.3 Tau蛋白学说11-12
• 1.1.4 氧化应激12-13
• 1.1.5 Cu~+/Cu~(2+)与AD13-14
• 1.1.6 神经元的缺失与AD14-15
• 1.2 硒蛋白R与肌动蛋白15-19
• 1.2.1 SelR的基本概述15-18
• 1.2.2 肌动蛋白（actin）概述18-19
• 1.2.3 Actin与神经细胞发育19
• 1.2.4 SelR与actin的潜在关系19
• 1.3 RHOA/ROCK通路与细胞发育19-21
• 1.3.1 Rho A/ROCK通路基本介绍19-21
• 1.4 本论文的研究意义与思路21-23
• 第2章 实验材料及方法23-46
• 2.1 实验材料23-26
• 2.1.1 实验所用大肠杆菌菌株和细胞株23
• 2.1.2 实验所用动物23
• 2.1.3 化学试剂及试剂盒23-25
• 2.1.4 实验仪器25-26
• 2.2 培养基及主要试剂的配制26-29
• 2.2.1 培养基的配置26-27
• 2.2.2 Western Blot试剂27-28
• 2.2.3 细胞免疫荧光试剂28
• 2.2.4 原代神经细胞培养试剂28
• 2.2.5 常用缓冲液和试剂的配制28-29
• 2.3 实验方法29-46
• 2.3.1 SelR突变体的制备29-36
• 2.3.2 Aβ_(42)样品的处理36
• 2.3.3 Cu~+/Cu~(2+)的外理36
• 2.3.4 BCA竞争结合法36
• 2.3.5 ThT荧光法36-37
• 2.3.6 SelR′对Cu~+/Cu~(2+) 诱导的Aβ_(42)毒性的影响37-39
• 2.3.7 siRNA的设计和筛选39-41
• 2.3.8 qPCR检测41-43
• 2.3.9 病毒感染 N2A 细胞43
• 2.3.10 海马神经元培养43-44
• 2.3.11 细胞免疫荧光44-46
• 第3章 实验结果46-54
• 3.1 S_(EL)R′通过与Cu~+/Cu~(2+)的结合来抑制AΒ42聚集及细胞毒性46-50
• 3.1.1 SelR′表达质粒的构建46
• 3.1.2 菌液PCR鉴定46-47
• 3.1.3 SelR′的表达纯化47
• 3.1.4 SelR′竞争结合Cu~+的性质47-48
• 3.1.5 SelR′对Cu~+/Cu~(2+)诱导的Aβ_(42)聚集的影响48-49
• 3.1.6 SelR′对Cu~+/Cu~(2+) 诱导的Aβ_(42)细胞毒性的影响49-50
• 3.2 S_(EL)R通过调节RHOA/ROCK通路影响AD50-54
• 3.2.1 鼠脑中SelR及Rho A/ROCK通路相关蛋白的差异表达50-51
• 3.2.2 N2A细胞中SelR与Rho A/ROCK通路的关系51-54
• 第4章 讨论54-58
• 第5章 结论58-59
• 参考文献59-66
• 致谢66-67
• 附件一、英文缩写对照表67

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本文编号：877848