京尼平苷调节β淀粉样蛋白神经毒性及其代谢的分子机制

发布时间：2017-09-21 05:16

  本文关键词：京尼平苷调节β淀粉样蛋白神经毒性及其代谢的分子机制

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【摘要】：阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病,其典型病理特征是β淀粉样蛋白(β-Amyloid,Aβ)在脑内异常积聚形成的淀粉斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结。由于其发病机制复杂,目前还没有十分有效的治疗方法。近年来,人们研究发现,激活胰高血糖素样肽-1受体(Glucagon-like peptide-1receptor,GLP-1R)表现出多种神经活性,在改善AD学习记忆和生化指标等方面具有明显的作用。因此,GLP-1受体已成为AD研究的热点。课题组通过高通量筛选的方法,发现并证实京尼平苷是一种新的GLP-1受体选择性激动剂,它通过激活GLP-1受体,促进c AMP释放,诱导PC12细胞神经样分化,显示出神经营养活性;而且,京尼平苷还能通过PI3K途径对抗多种氧化应激诱导的神经细胞氧化损伤,表现出神经保护作用。但是,京尼平苷能否拮抗Aβ诱导的神经损伤,其作用机制如何?京尼平苷对Aβ代谢和tau磷酸化有何影响?这些问题目前还不清楚。首先,本文在前期工作基础上考察了京尼平苷对Aβ1-42诱导的原代皮层神经元神经损伤的保护作用及其机制。结果证实,京尼平苷可明显抑制Aβ1-42诱导的神经毒性,而且京尼平苷的这种神经保护作用与其调节激活GLP-1受体、上调Aβ降解关键酶-胰岛素降解酶(Insulin-degrading enzyme,IDE)的表达水平有关。随后,利用酶活性抑制阻断的方法在原代培养的皮层神经元中考察了京尼平苷调节IDE表达的细胞信号转导途径。实验发现,PKA抑制剂(H89)、EGFR抑制剂(AG1478)、PI3K抑制剂(LY294002)、c-Src抑制剂(PP1)以及PPARγ拮抗剂(GW9662)均可明显抑制京尼平苷对IDE基因表达的上调作用,表明京尼平苷上调IDE表达与上述信号通路有关。进一步研究发现,京尼平苷还可以增强PPARγ磷酸化,加速磷酸化Fox O1从胞核转运到胞浆,从而解除对IDE基因启动子活性的抑制,间接增强IDE基因表达。其次,为了探索京尼平苷对Aβ代谢和tau磷酸化的影响及其分子机制,利用ELISA和Western blot方法测定了京尼平苷对链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导的胰岛素缺陷动物脑内Aβ和tau磷酸化水平的影响,以及京尼平苷对脑内胰岛素信号的调节作用。结果显示,京尼平苷可明显降低胰岛素缺陷诱导的Aβ1-42的生成和tau磷酸化,而且京尼平苷抑制Aβ1-42生成与其上调胰岛素信号调节Aβ分泌酶的表达水平有关。最后,在原代培养的皮层神经元中考察了胰岛素信号在京尼平苷调节Aβ1-42生成和tau磷酸化过程中的作用及细胞信号转导过程。结果发现,京尼平苷可增强胰岛素信号介导的Akt磷酸化,上调ADAM10(α分泌酶)、抑制BACE1(β分泌酶)表达,进而减少Aβ1-42的产生;同时,京尼平苷还可通过增强GSK-3β磷酸化,降低tau蛋白磷酸化水平。综上所述,本文首次阐明了京尼平苷激活GLP-1受体调节IDE基因表达,进而拮抗Aβ1-42诱导的神经损伤的分子机制和细胞信号转导过程;同时,在细胞和整体动物水平上明确了京尼平苷增强胰岛素信号调节Aβ代谢和tau磷酸化的分子机制,为AD的治疗提供了新的思路和靶点。
【关键词】：京尼平苷 胰岛素降解酶 β淀粉样蛋白 胰高血糖素样肽-1受体 阿尔兹海默症
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-13
• 1 绪论13-31
• 1.1 阿尔兹海默症现状13
• 1.2 阿尔兹海默症的病理学特征13-16
• 1.2.1 阿尔兹海默症的病理学特征之一：Aβ 代谢紊乱13-15
• 1.2.2 阿尔兹海默症的病理学特征之二：tau磷酸化异常15-16
• 1.3 阿尔兹海默症治疗药物研究进展16-19
• 1.3.1 以Aβ 为靶点的药物16
• 1.3.2 以tau磷酸化为治疗靶点的药物16-17
• 1.3.3 乙酰胆碱酯酶抑制剂17
• 1.3.4 防治阿尔兹海默症的天然活性成分17-18
• 1.3.5 其他药物18-19
• 1.4 胰岛素降解酶与阿尔兹海默症19-20
• 1.5 GLP-1 受体与阿尔兹海默症20-23
• 1.5.1 GLP-1 受体研究进展20-21
• 1.5.2 GLP-1 信号通路21-22
• 1.5.3 GLP-1 受体激动剂在阿尔兹海默症防治中的应用22-23
• 1.6 京尼平苷的研究进展23-28
• 1.6.1 京尼平苷的理化性质24
• 1.6.2 京尼平苷的分离提取及含量测定24
• 1.6.3 京尼平苷的药理学研究进展24-26
• 1.6.4 京尼平苷的药代动力学研究26-28
• 1.7 本文的立论依据和研究内容28-31
• 2 京尼平苷拮抗Aβ_1-42诱导的神经损伤的分子机制31-43
• 2.1 前言31-32
• 2.2 实验材料32-33
• 2.2.1 实验细胞和动物32
• 2.2.2 主要试剂32
• 2.2.3 主要溶液32-33
• 2.2.4 主要仪器33
• 2.3 实验方法33-37
• 2.3.1 原代大鼠皮层神经元的分离与培养33-34
• 2.3.2 Aβ_1-42寡聚体的制备34
• 2.3.3 Th T荧光法检测京尼平苷对Aβ_1-42聚合的影响34
• 2.3.4 MTT法考察京尼平苷对Aβ_1-42处理的原代皮层神经元活力的影响34
• 2.3.5 DH5α 感受态细胞制备及质粒纯化34-36
• 2.3.6 测定蛋白浓度36
• 2.3.7 RT-PCR36
• 2.3.8 Western blot分析36-37
• 2.3.9 统计分析37
• 2.4 实验结果37-41
• 2.4.1 Aβ_1-42对原代神经元活力的影响37
• 2.4.2 京尼平苷对Aβ_1-42诱导的原代神经元活力的影响37-38
• 2.4.3 GLP-1 受体与京尼平苷神经保护作用的相关性38-39
• 2.4.4 京尼平苷对Aβ_1-42聚合的影响39
• 2.4.5 京尼平苷对IDE表达的影响39
• 2.4.6 IDE拮抗剂对京尼平苷拮抗Aβ_1-42诱导的神经元损伤的影响39-41
• 2.5 讨论41-42
• 2.6 本章小结42-43
• 3 京尼平苷调节胰岛素降解酶基因表达拮抗Aβ 神经毒性的细胞信号转导机制43-55
• 3.1 前言43-44
• 3.2 实验材料44-45
• 3.2.1 实验细胞和动物44
• 3.2.2 主要试剂44
• 3.2.3 主要溶液44-45
• 3.2.4 主要仪器45
• 3.3 实验方法45-46
• 3.3.1 原代大鼠皮层神经元的分离与培养45
• 3.3.2 制备胞浆、胞核蛋白45-46
• 3.3.3 测定蛋白浓度46
• 3.3.4 报告基因法分析京尼平苷对IDE启动子活性的影响46
• 3.3.5 EMSA方法分析PPARγ 与IDE启动子之间的相互作用46
• 3.3.6 Western blot分析46
• 3.3.7 统计分析46
• 3.4 实验结果46-52
• 3.4.1 抑制剂对京尼平苷调节IDE表达的影响46-48
• 3.4.2 c-Src和EGFR信号通路在京尼平苷调节IDE表达中的作用48-49
• 3.4.3 京尼平苷对磷酸化Fox O1在细胞内转运的影响49-50
• 3.4.4 京尼平苷对磷酸化PPARγ 在细胞内转运的影响50-51
• 3.4.5 PPARγ 与IDE启动子之间的相互作用51
• 3.4.6 京尼平苷对PPARγ 与IDE启动子之间相互作用的影响51-52
• 3.5 讨论52-53
• 3.6 本章小结53-55
• 4 京尼平苷对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ 代谢和tau磷酸化的调节作用及其机制55-73
• 4.1 引言55-56
• 4.2 实验材料56-57
• 4.2.1 实验动物56
• 4.2.2 主要试剂56
• 4.2.3 主要溶液56-57
• 4.2.4 主要仪器57
• 4.3 实验方法57-59
• 4.3.1 动物模型的建立及分组57
• 4.3.2 测定血糖值57
• 4.3.3 制备脑组织匀浆57
• 4.3.4 测定蛋白浓度57-58
• 4.3.5 ELISA分析58-59
• 4.3.6 Western blot分析59
• 4.3.7 统计分析59
• 4.4 实验结果59-69
• 4.4.1 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ1-40、Aβ1-42表达的影响59-60
• 4.4.2 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内胰岛素表达的影响60-61
• 4.4.3 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内胰岛素受体 (IR)表达的影响61-62
• 4.4.4 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内胰岛素受体底物-1 (IRS-1)和胰岛素受体底物-2 (IRS-2)表达的影响62-63
• 4.4.5 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内 β-分泌酶 (BACE1)表达的影响 5163-65
• 4.4.6 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内 α-分泌酶 (ADAM10)表达的影响65-66
• 4.4.7 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内 γ-分泌酶 (PS1)表达的影响66-67
• 4.4.8 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内APP表达的影响67-68
• 4.4.9 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内IDE表达的影响68
• 4.4.10 京尼平苷对胰岛素缺陷APP/PS1转基因小鼠脑内tau磷酸化的影响68-69
• 4.5 讨论69-71
• 4.6 本章小结71-73
• 5 京尼平苷调节皮层神经元中Aβ 代谢和tau磷酸化的细胞信号转导机制73-85
• 5.1 引言73
• 5.2 实验材料73-75
• 5.2.1 实验细胞和动物73-74
• 5.2.2 主要试剂74
• 5.2.3 主要溶液74
• 5.2.4 主要仪器74-75
• 5.3 实验方法75
• 5.3.1 原代大鼠皮层神经元的分离与培养75
• 5.3.2 测定蛋白浓度75
• 5.3.3 ELISA分析75
• 5.3.4 Western blot分析75
• 5.3.5 统计分析75
• 5.4 实验结果75-82
• 5.4.1 京尼平苷对原代神经元Aβ1-42表达的影响75-76
• 5.4.2 京尼平苷对原代神经元APP表达的影响76
• 5.4.3 京尼平苷对原代神经元 α-, β-和 γ-分泌酶表达的影响76-77
• 5.4.4 京尼平苷和/或胰岛素对原代神经元Akt磷酸化的影响77-79
• 5.4.5 京尼平苷和/或胰岛素对原代神经元GSK-3β 磷酸化的影响79-81
• 5.4.6 京尼平苷和/或胰岛素对原代神经元tau磷酸化的影响81-82
• 5.5 讨论82-83
• 5.6 本章小结83-85
• 6 结论与展望85-87
• 6.1 结论85
• 6.2 展望85-87
• 7 本文的创新点87-89
• 致谢89-91
• 参考文献91-113
• 附录113-114
• A. 作者在攻读学位期间发表及拟发表论文目录113-114
• B. 作者在攻读学位期间参与的专利目录114
• C. 作者在攻读学位期间参与的科研项目目录114

【参考文献】

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本文编号：892584