NFκB上调SET基因的表达及其分子机制研究

发布时间：2017-09-21 12:52

  本文关键词：NFκB上调SET基因的表达及其分子机制研究

  更多相关文章： 阿尔兹海默病 SET NFκB Sp1 转录 棉鼠 肺表面活性蛋白D 克隆 表达 脂多糖

【摘要】：目的:在阿尔兹海默病和唐氏综合症患者的大脑中发现SET蛋白的升高,并滞留于神经元的细胞浆中。胞质滞留的SET蛋白会引起蛋白磷酸酶2A的抑制,最终促进了阿尔兹海默病中tau蛋白的病理进展。本研究以人类SET基因为研究对象,主要研究核转录因子NFκB对SET基因的转录调控及其分子机制。材料和方法:5’-RACE,荧光素酶报告基因质粒构建,细胞培养与转染,荧光素酶活性检测及结果分析,核蛋白提取,电泳迁移率分析,RT-PCR结果:1.用5’-RACE方法和基因特异性扩增技术获得一长约200bp核酸片段,克隆进pc DNA4/myc-His载体,测序分析结果显示与外源寡聚核苷酸序列相接的首个碱基为SET基因翻译起始位点(ATG)上游123bp处的胞嘧啶C。2.扩增SET基因启动子区-1276至+123共1399bp区域内不同长度序列,将片段插入载体p GL3-basic构建重组荧光素酶报告基因质粒p SET-A至p SET-I共9个。荧光素酶活性检测结果显示p SET-C(-483/+123)的相对荧光素酶活性为(131.75±9.87RLU)。3.转录因子预测分析提示SET基因启动子-483/+123区域共有8个核转录因子结合位点。8个位点分别突变后检测荧光素酶活性提示靠近+123端的2个SP1和1个NFκB突变后启动子活性明显下降。4.质粒p SET-C和p MTF-p65或p CGN-Sp1共转染,结果显示在HEK293细胞系中荧光素酶活性分别提高了1.92倍(p0.0001)或1.47倍(p0.05),在SH-SY5Y细胞系中p MTF-p65提高了荧光素酶活性1.37倍(p0.05)而SP1无影响。在SH-SY5Y细胞系中,缺乏NF?B结合位点的p SET-F、p SET-G和含有突变NFκB结合位点的p SET-C MH与p MTF-p65共转后荧光素酶活性无升高。5.电泳迁移率分析提示人类SET基因启动子+107至+116bp为一个具有功能活性的NF?B结合位点。6.过表达或活化NF?B在HEK293细胞系中对SET基因m RNA水平无显著影响。在SH-SY5Y细胞中,过表达或活化NF?B可分别增加SET蛋白亚型1的m RNA水平56.94%或73.70%,对亚型2的m RNA水平无显著影响。结论:1.人类SET基因主要的转录起始位点为其翻译起始位点ATG上游123bp处的胞嘧啶C。2.人类SET基因-483至+123片段具有显著启动子活性,为SET基因功能启动子区。3.核转录因子NFκB能提高人类SET基因启动子活性。4.人类SET基因有复杂且精确的调控机制,NFκB能与其启动子有效结合。5.核转录因子NFκB能上调人类SET蛋白亚型1的转录水平,对亚型2无影响,提示2种亚型具有不同的调控方式。目的:初步探讨棉鼠肺表面活性蛋白D(Surfactant-associated protein D,SP-D)核苷酸和氨基酸序列与其他物种间的同源性和交叉反应性,观察SP-D m RNA水平和SP-D蛋白在棉鼠肺损伤模型中的表达规律,为探究呼吸道疾病发病机制提供科学的实验依据。材料和方法:SPF级棉鼠32只随机分为生理盐水对照组和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)实验组(实验组再按给药后24、48和96h分为3个亚组,每组8只)。实验组采用腹腔注射给予2mg/kg的脂多糖,对照组给予相当剂量的生理盐水。提取棉鼠肺总RNA,经RT-PCR扩增SP-D基因并克隆测序,采用生物信息学软件对测序结果进行同源性和系统进化分析;HE染色观察各组棉鼠肺组织病理学变化;q RT-PCR检测SP-D m RNA水平;Western blot检测SP-D蛋白表达。结果:棉鼠SP-D基因开放阅读框含1113bp,编码370个氨基酸,与部分已知其他物种SP-D核苷酸和氨基酸序列同源性分别在75.64%-90.01%和72.68%-88.56%之间;在SP-D基因构建的系统进化树上,棉鼠与其他啮齿类动物形成一个独特的分支;与对照组相比,实验组肺组织病理特征性变化随LPS刺激时间延长而加剧;SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表达水平随LPS处理时间的延长而逐渐增加,在LPS处理24h后,SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表达开始明显增加并出现统计学差异(P0.05),48h时后SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表达水平均增加到峰值,96h后两者仍保持较高水平,与对照组相比具有极显著性差异(P0.01)。结论:棉鼠SP-D核苷酸和氨基酸序列与其他物种间具有较高同源性,且棉鼠和其他物种SP-D蛋白间存在交叉反应性;棉鼠SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表达水平在肺损伤模型中均存在时间依赖性,可作为判断肺损伤疾病不同发展阶段的生物标记。
【关键词】：阿尔兹海默病 SET NFκB Sp1 转录 棉鼠 肺表面活性蛋白D 克隆 表达 脂多糖
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-5
• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-15
• 第一部分 NFκB上调SET基因的表达及其分子机制研究15-42
• 前言15-16
• 1 材料与方法16-31
• 2 结果31-37
• 3 讨论与总结37-39
• 参考文献39-42
• 第二部分 棉鼠SP-D基因的克隆及其在LPS诱导肺损伤模型中的表达分析42-55
• 前言42
• 1 材料与方法42-45
• 2 结果45-50
• 3 讨论50-53
• 参考文献53-55
• 文献综述55-67
• 参考文献62-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士研究生期间发表的学术论文68

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 许波群;李瑛;薛凯;李梅;马翔;刁飞扬;崔毓桂;刘嘉茵;;人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定[J];医学研究生学报;2010年02期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 冯怡;NFκB上调SET基因的表达及其分子机制研究[D];重庆医科大学;2016年

，

本文编号：894648