NGF和BDNF联合诱导NSC分化及其在192-IgG-saporin致阿尔茨海默病模型鼠中的应用

发布时间：2017-09-23 19:14

  本文关键词：NGF和BDNF联合诱导NSC分化及其在192-IgG-saporin致阿尔茨海默病模型鼠中的应用

  更多相关文章： 神经干细胞 神经球 单层贴壁培养 分化 神经生长因子 脑源性神经生长因子 分化 碱性螺旋-环-螺旋 老年痴呆症 水迷宫 胆碱能神经元 突触素 胆碱能纤维

【摘要】：研究背景：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种常见的神经退行性疾病，，其主要特征是进行性的不可逆转的记忆和认知功能衰退，主要的病理学变化包括胆碱能神经元丢失。神经干细胞(Neural stem cell, NSC)是一类非常重要的多潜能干细胞，有能力分化为神经元或神经胶质细胞，在细胞移植治疗以神经元丢失为主要特征的神经系统疾病中有潜在的应用前景。NSC在体外可以进行神经球悬浮培养和单层贴壁培养，也可以在两者之间进行转换。NSC分化机制非常复杂，而且受多方面因素的影响。研究表明，神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)不但可以维持神经元的生长和存活，还可以促进NSC增殖并诱导其分化为神经元。NGF和BDNF通过与NSC表面的受体Trk结合，激活MAPK/ERK信号通路，参与NSC的增殖分化调控。转录因子的表达变化对NSC的增殖分化也有非常重要的调节作用。碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族中的HES1和HES5成员，有维持NSC增殖并抑制其分化的作用，另外的家庭成员如MASH1，NGN1和NeuroD则可促进NSC分化。了解NSC的分化机制，主要是为了把NSC应用于细胞移植代替疗法治疗神经退行性疾病。研究表明，NSC移植可以改善受损神经的功能，经NGF或BDNF处理的NSC在移植后的存活和迁移能力都更高。 第一部分胚胎大鼠神经干细胞的体外培养 目的建立NSC体外培养方案，使NSC在体外可以得到增殖和分化。方法无菌条件下取SD大鼠胚胎端脑，无血清悬浮培养，形成P2代神经球后，将神经球消化成单细胞，分为神经球悬浮培养和单层贴壁培养，并对两种不同培养方式下的NSC进行干性鉴定和分化能力鉴定。结果神经球悬浮培养和单层贴壁培养均可得到的NSC，单层贴壁培养的细胞Nestin阳性率有93.17±3.06%；分化3d后，在不加入诱导因子的情况下，悬浮培养的神经球β-tubulin Ⅲ阳性细胞为11.91±2.73%，单层贴壁培养的NSC分化后β-tubulin Ⅲ阳性细胞率为19.55±1.09%。结论先经过两代神经球悬浮培养后，再转化进行单层贴壁培养的NSC更利于分化为神经元。 第二部分NGF联合BDNF对体外培养的神经干细胞分化为神经元的影响 目的研究单独使用NGF或BDNF和两个因子联合应用对神经干细胞分化为 神经元的影响，并探讨可能的分子机制。方法将单层贴壁培养的细胞分为四组，对照组，NGF组，BNDF组，BNDF和NGF联合组。在诱导分化1d，3d，7d和14d时用免疫荧光技术检测各组神经元分化比例，用荧光定量PCR(Q-PCR)技术检测HES1，HES5，MASH1，NGN1和NeuroD表达量的变化。在应用MEK抑制剂PD98059处理细胞的情况下，蛋白免疫印迹(WB)技术用于检测不同组MEK下游信号蛋白磷酸化的ERK(p-ERK)的水平变化。结果单独使用NGF或BDNF都可以诱导神经元分化，诱导3d时神经元比例分别为31%和35%，BDNF和NGF联合诱导时，神经元比例更高，诱导3d时约为39%，各组间差异有统计学意义(P＜0.01)。WB结果表明，在使用和不使用MEK抑制剂PD98059的情况下，NGF组和BDNF组都比对照组p-ERK水平高，联合组比NGF组和BDNF组的p-ERK水平高，各组间差异有统计学意义(P＜0.01)。Q-PCR结果表明HES1和HES5在诱导分化后明显降低，但各组间差异无统计学意义；MASH1、NGN1和NeuroD表达在诱导分化后有明显上升，联合组比NGF组和BDNF组表达水平明显提高，各组间差异有统计学意义(P＜0.05)。结论p-ERK，MASH1，NGN1和NeuroD的水平在各组间的变化差异与神经元分化比例有着正相关的联系，所有这些结果都表明联合应用NGF和BDNF可以提高对NSC分化为神经元的影响，这为我们下一步的在体实验提供理论依据和实验基础。 第三部分NGF和BDNF联合神经干细胞在192-IgG-saporin致阿尔茨海默病模型鼠中的应用 目的探讨不同诱导方案下混合细胞的移植对192-IgG-saporin致AD模型动物的影响。方法将动物分为5组，假手术组，AD模型组，NGF组，BDNF组，联合组。假手术组用等体积的生理盐水代替192-IgG-saporin，动物建模3w后，用NGF，BDNF和联合因子诱导NSC，将诱导3d后的混合细胞移植到受损动物的基底前脑，这3组动物简称为NGF组，BDNF组和联合组。细胞移植4周后，水迷宫检测不同组动物的学习记忆能力，免疫组织化学检测不同组动物基底前脑胆碱能神经元数量的改变和海马突触素的改变，组织化学方法检测海马AChE纤维的改变。结果模型组学习记忆能力明显下降，细胞移植组可以明显提高受损动物的学习记忆能力，其中联合组第4d的逃避潜伏期缩短至8.87±0.26s，第5d空间搜索实验穿越平台次数为5.33±1.15次，与模型组差异有统计学意义(P＜0.05)；联合组基底前脑胆碱能神经元数量为96.00±6.20，恢复到假手术组的98.16%，海马突触素OD值恢复到假手术组的92.45%，AChE纤维数量恢复到假手术组的95.41%。结论用NGF和BDNF体外诱导NSC3d，再将混合细胞移植到受损动物，可以明显提高受损动物的学习记忆能力，补充胆碱能神经元数量，提高海马突触素和AChE纤维数量，联合诱导比单因子诱导的效果更明显。 总结： 1.将NSC先悬浮培养到P2代的神经球，再转化成单层贴壁培养，更利于NSC向神经元方向分化。 2. NGF和BDNF联合应用比单独应用时可以诱导更多的NSC分化为神经元，p-ERK，MASH1，NGN1和NeuroD的水平在各组间的变化差异与神经元分化比例有着正相关的联系，这些结果都表明联合应用NGF和BDNF可以提高对NSC分化为神经元的影响，这为我们下一步的在体实验提供理论依据和实验基础。 3.用NGF或(和)BDNF体外诱导NSC分化3d，再将混合细胞移植到模型鼠受损侧的基底前脑，可以明显提高受损动物的学习记忆能力，补充胆碱能神经元数量，提高海马突触素和AChE纤维数量，联合诱导比单因子诱导的效果更明显。
【关键词】：神经干细胞 神经球 单层贴壁培养 分化 神经生长因子 脑源性神经生长因子 分化 碱性螺旋-环-螺旋 老年痴呆症 水迷宫 胆碱能神经元 突触素 胆碱能纤维
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16;R-332
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 主要符号中英文对照表13-15
• 前言15-21
• 1 神经干细胞及其在神经系统中的作用15-16
• 2 NSC 可以在体外培养增殖16
• 3 影响 NSC 分化的因素16-19
• 3.1 神经营养因子对 NSC 分化的影响16-17
• 3.2 MAPK/ERK 信号通路对 NSC 分化的影响17-18
• 3.3 转录因子对 NSC 分化的影响18-19
• 4 NSC 在神经退行性疾病中的应用前景19-20
• 5 本研究的立题依据和创新点20-21
• 第一部分 胚胎大鼠神经干细胞的体外培养21-33
• 1 材料和方法21-27
• 1.1 动物、主要试剂和仪器21-23
• 1.2 NSC 的取材、培养和传代23
• 1.3 NSC 的分化23-24
• 1.4 NSC 的干性鉴定和分化能力鉴定24
• 1.5 免疫细胞化学/免疫荧光24-25
• 1.6 Q-PCR 步骤25-27
• 1.6.1 RNA 的提取25
• 1.6.2 逆转录合成 cDNA 第一链25-26
• 1.6.3 Q-PCR 反应检测基因表达26-27
• 1.7 统计学分析27
• 2 结果27-30
• 2.1 NSC 的培养和增殖及干性签定27-28
• 2.2 NSC 的分化能力鉴定28-30
• 3 讨论30-32
• 3.1 NSC 的体外培养方案30
• 3.2 影响 NSC 分化的因素30-31
• 3.3 NSC 体外培养的不足31
• 3.4 神经球转化为单层贴壁培养的优点31-32
• 4. 结论32-33
• 第二部分 NGF 联合 BDNF 对体外培养的神经干细胞分化为神经元的影响33-56
• 1 材料和方法33-41
• 1.1 动物、主要试剂和仪器33-35
• 1.2 NSC 的取材和培养35
• 1.3 单独使用 NGF 或 BDNF 和两个因子的联合应用35-36
• 1.3.1 NGF 和 BDNF 浓度的确定35
• 1.3.2 因子的单独使用和联合应用对 NSC 分化及相关分子改变的影响35-36
• 1.4 免疫细胞化学/免疫荧光36
• 1.5 Q-PCR 步骤36-37
• 1.6 总蛋白的提取和浓度测定37-38
• 1.6.1 细胞裂解提取总蛋白37
• 1.6.2 蛋白浓度测定37-38
• 1.7 蛋白免疫印迹38-41
• 1.7.1 WB 试剂准备38-39
• 1.7.2 WB 分离胶和浓缩胶的制备39-40
• 1.7.3 WB 操作步骤40-41
• 1.8 统计学分析41
• 2 结果41-52
• 2.1 NGF 和 BDNF 诱导单层贴壁培养 NSC 分化41-43
• 2.2 比较因子的单独使用和联合应用对 NSC 分化的影响43-47
• 2.3 WB 检测 PD98059 对 P-ERK 的水平变化和神经元分化比例的影响47-49
• 2.4 Q-PCR 检测 NGF 或(和)BDNF 对 bHLH 家庭基因的表达变化的影响49-52
• 3 讨论52-54
• 3.1 NGF 和 BDNF 对 NSC 分化为神经元的叠加作用52-53
• 3.2 ERK 的磷酸化参与 NGF 和 BDNF 对 NSC 的叠加作用53
• 3.3 MASH1、NGN1 和 NeuroD 的表达变化参与 NGF 和 BDNF 对 NSC 的叠加作用53-54
• 3.4 NSC 在细胞移植中的前景和挑战54
• 4. 结论54-56
• 第三部分 NGF和BDNF联合神经干细胞在192-IgG-saporin致阿尔茨海默病模型鼠中的应用56-73
• 1 材料和方法56-62
• 1.1 动物、主要试剂和仪器56-57
• 1.2 SD 大鼠侧脑室的 192-IgG-saporin 注射57-58
• 1.3 水迷宫行为学测试58-59
• 1.3.1 Morris 水迷宫实验装置58
• 1.3.2 定位航行实验(隐藏平台实验)58-59
• 1.3.3 空间搜索实验59
• 1.4 NSC 的培养，诱导分化和移植59
• 1.5 动物的灌注及组织切片59-60
• 1.6 形态学检测60-62
• 1.6.1 免疫组织化学检测 p75NGFR受体和突触素60
• 1.6.2 海马切片 AChE 纤维染色60-61
• 1.6.3 切片脱水透明61-62
• 1.7 统计学分析62
• 2 结果62-70
• 2.1 Morris 水迷宫比较不同组之间的行为学差异62-64
• 2.2 胆碱能神经元在不同组间的差别64-66
• 2.3 突触素染色在不同组间的差别66-68
• 2.4 AChE 染色在不同组间的差别68-70
• 3. 讨论70-72
• 3.1 192-IgG-saporin 致 AD 模型的建立70
• 3.2 NSC 对 AD 模型鼠的影响70-71
• 3.3 NGF 和 BDNF 联合 NSC 对 AD 模型鼠的影响71-72
• 4 结论72-73
• 全文总结和展望73-74
• 参考文献74-84
• 综述84-91
• 参考文献88-91
• 作者简介91-94
• 附录94-95
• 攻读学位期间的研究成果95-96
• 致谢96-97

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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8 潘学兵;龙大宏;罗秀梅;涂腊根;潘丽;王桂平;;神经干细胞移植对192-IgG-saporin阿尔茨海默病模型鼠基底前脑神经元p75~(NGFR)阳性神经元和行为学的影响[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年45期

本文编号：907005