体外大鼠牙囊细胞促大鼠骨髓间充质干细胞增殖和分化的初步研究

发布时间：2017-10-09 17:20

  本文关键词：体外大鼠牙囊细胞促大鼠骨髓间充质干细胞增殖和分化的初步研究

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【摘要】：目的：本实验采用充分发挥细胞自身作用的共培养实验方法,建立rBMSCs与rDFCs共培养系统,模拟机体环境,探讨与rDFCs共培养的rBMSCs增殖与成骨分化效应,以期优化牙周组织工程的种子细胞,促进牙周组织工程的良好发展。方法：1.分离大鼠下颌骨,显微镜下取出牙囊,获取原代rDFCs培养原代rDFCs,传代纯化及组织学来源鉴定。2.大鼠后肢股骨和胫骨的分离,全骨髓贴壁法获取rBMSCs,原代培养rBMSCs,传代纯化及组织学来源鉴定。3.建立rDFCs和rBMSCs共培养系统,24孔板接种6孔rBMSCs,24h后与24孔板嵌套的Transwell小室接种rDFCs,共培养3,5,7,9d,采用CCK8法检测各组rBMSCs的细胞增殖活性。4. rBMSCs接种于6孔板,使用不含FBS的培养基24h,达到细胞周期同步化,与6孔板嵌套的Transwell小室接种rDFCs,建立rDFCs和rBMSCs共培养系统,共培养3,5,7,9d,4度预冷75%乙醇固定,FCM检测处于S期+G2期的各组rBMSCs细胞数占总细胞数的百分比。5. rBMSCs接种于12孔板,24h后rDFC接种于与12孔板嵌套的Transwell小室,建立rDFCs和rBMSCs共培养系统,设置4个复孔,共培养7d,14d后,AKP和BCA试剂盒检测OD值,通过相关计算公式,得出各组rBMSCs细胞内AKP.活性。6.6孔板接种rBMSCs,24h后与其嵌套的Transwell小室接种rDFCs,建立rDFCs和rBMSCs共培养系统,共培养10d,RT-PCR检测相关成骨基因BSP,OCN,COL-I,Runx2的表达情况。结果：1.免疫组织化学鉴定结果证明细胞来源于外胚层间充质,结合形态学观察和取材部位,证明获取的细胞为rDFCs。2.成脂、成骨定向诱导及流式细胞仪检测细胞特定抗原表达结果结合形态学观察和取材部位,证明获取的细胞为rBMSCs。3.CCK-8和流式细胞仪检测rBMSCs的增殖活性,结果表明共培养5d和7d处理组的增殖活性明显强于对比组,统计分析有差异。4. rBMSCs细胞内AKP活性检测,共培养7d和14d后,各组细胞内AKP活性均增强,处理组的AKP活性和对比组相比,统计分析有差异。5. RT-PCR检测rBMSCs相关成骨基因的表达情况,共培养10d后,处理组的BSP、OCN、COL-I和Runx2基因的相对表达量上调均高于对比组,统计分析有差异。结论：rBMSCs与rDFCs共培养后,rBMSCs增殖活性增加、细胞内AKP活性增强,相关成骨基因BSP、OCN、COL-I和Runx2表达明显上调；因此,BMSCs在牙周组织工程有着广阔的发展前景。
【关键词】：牙囊细胞 骨髓间充质干细胞 细胞共培养 替代分化
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 第一部分 两种实验细胞的组织分离、细胞原代培养、传代纯化及来源鉴定15-28
• 前言15-16
• 第一节 大鼠牙囊分离、细胞原代培养、传代纯化及来源鉴定16-20
• 1 材料与方法16-18
• 1.1 主要仪器与试剂材料16
• 1.2 方法16-18
• 2 结果18-20
• 2.1 rDFCs生长状况18-19
• 2.2 rDFCs组织学来源鉴定19-20
• 3 小结20
• 第二节 分离大鼠股骨和腔骨骨髓、细胞原代培养、传代纯化及来其源鉴定20-25
• 1 材料与方法20-23
• 1.1 主要仪器与试剂材料20-21
• 1.2 方法21-23
• 2 结果23-25
• 2.1 rBMSCs生长状况23-24
• 2.2 rBMSCs组织学鉴定24-25
• 3 小结25
• 讨论25-28
• 第二部分 rDFCs体外共培养对r BMSCs增殖活性的研究28-36
• 前言28
• 第一节 CCK-8检测r DFCs对r BMSCs增殖活性的影响28-31
• 1 材料与方法28-30
• 1.1 主要仪器与试剂材料28-29
• 1.2 方法29-30
• 2 结果30
• 3 小结30-31
• 第二节 FCM检测rDFCs对r BMSCs增殖活性的影响31-34
• 1 材料与方法31-32
• 1.1 主要仪器与试剂材料31
• 1.2 方法31-32
• 2 结果32-33
• 3 小结33-34
• 讨论34-36
• 第三部分 rDFCs体外共培养对r BMSCs成骨分化的研究36-46
• 前言36-37
• 第一节 体外共培养rDFCs对r BMSCs的AKP活性的影响37-40
• 1 材料与方法37-38
• 1.1 主要仪器与试剂材料37
• 1.2 方法37-38
• 2 结果38-39
• 3 小结39-40
• 第二节 与rDFCs体外共培养的r BMSCs成骨基因表达的研究40-43
• 1 材料与方法40-42
• 1.1 主要仪器与试剂材料40
• 1.2 方法40-42
• 2 结果42-43
• 2.1 BSP.OCN.COL-1.Runx2基因半定量PCR产物电泳图42
• 2.2 BSP,OCN,COL-1,Runx2基因的RT-PCR检测结果42-43
• 3 小结43
• 讨论43-46
• 全文总结46-47
• 参考文献47-53
• 文献综述53-60
• 参考文献56-60
• 致谢60-61
• 攻读硕士期间发表的论文61

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本文编号：1001436