干细胞源性纤维软骨自组装基体的构建及力学性能研究

发布时间：2017-10-14 07:05

  本文关键词：干细胞源性纤维软骨自组装基体的构建及力学性能研究

  更多相关文章： 山羊骨髓间充质干细胞 组织工程 压缩实验 颞下颌关节盘

【摘要】：类似于关节软骨,关节盘缺损后难以自我修复。目前常规的手术治疗可造成病人的持续性疼痛和关节功能障碍,因此未来功能性颞下颌关节盘置换的发展是非常必要的。功能性修复关节盘组织因为组织工程技术的成熟发展而有了新的希望。在组织工程中,种子细胞—作为其理论中的三要素之一,对关节盘组织再生有着重要的影响。限于关节盘细胞高度分化性、体外培养迅速脱分化失去软骨表型等特点,直接利用关节盘细胞对缺损组织进行修复面临着细胞来源稀缺的难题。近年,间充质干细胞的持续深入研究,启发了研究者对关节盘组织工程种子细胞来源的新思路。基于干细胞的多向分化性,研究者试图通过物理学、生物学、化学等因素实现对干细胞的诱导并应用于组织工程中。本次研究主要通过生长因子定向诱导及与山羊颞下颌关节盘细胞直接共培养两种方法诱导并构建自组装山羊骨髓间充质干细胞纤维软骨基体,同时改善并提高干细胞源性基体的力学性能,为成功构建干细胞源性关节盘组织用于临床修复打下基础。本研究证明了直接共培养体系与生长因子定向诱导干细胞源性基体具有相似的力学性能,这为后期改善工程化关节盘的性能提供参考依据。内容分为以下三个部分:第一部分percoll密度梯度离心法和全骨髓培养法对山羊骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定比较;目的:比较percoll密度梯度离心法和全骨髓培养法体外培养山羊骨髓间充质干细胞的纯度并评估其生物学特性,为后期实验摸清实验条件并提供大量细胞源。方法:无菌收取3-5月龄山羊股骨骨髓组织,分别采用percoll密度梯度离心法和全骨髓培养法体外分离gBMSCs,相差显微镜下每日观察细胞形态;取生长良好的P3代细胞,绘制细胞生长曲线;成纤维细胞集落形成单位实验检测其自我更新能力;流式细胞术检测细胞表面标志物表达。结果:两组中原代及传代细胞均呈漩涡状排列生长,两种分离方法获得的P3代细胞“S”形生长曲线形态相似,全骨髓培养法分离的细胞在成纤维细胞集落形成能力中表现出更高的自我更新能力,流式结果显示两者表面标志表达相似,其中CD34、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。结论:不论密度梯度离心法还是全骨髓培养法,均可得到形态均一、具有自我更新潜力的gbmscs。但原代培养过程中密度梯度离心法提取的细胞增殖速度慢,到第3代时除细胞自我更新能力外其余细胞生物学特性无明显差异。第二部分tgf-β1、bmp-2联合诱导对自组装山羊骨髓间充质干细胞纤维软骨基体的影响;目的:诱导并构建自组装山羊骨髓间充质干细胞纤维软骨基体,观察其生物学特征并检测力学性能,期望进一步探索新的途径用于颞下颌关节盘组织工程的成功构建。方法:分离、培养山羊骨髓间充质干细胞,rt-qpcr检测软骨相关基因表达水平;按5.5×106/井接种到预制琼脂糖井内,每日更换诱导液(10ng/mltgf-β1,500ng/mlbmp-2,10-7mdex,1×its,50mg/lascorbicacid,40μg/mlproline,100μg/mlpyruvicacid,100u/mlpenicillin/100mg/mlstreptomycin)培养至42d;于14d、28d、42d时观察和检测自组装gbmscs纤维软骨基体形态、成分变化及基体抗压缩力学性能。结果:经过14d诱导后,诱导组rt-qpcr检测软骨相关基因(colⅠ、colⅡ、colⅩ、sox9、gag)的相对表达量显著高于对照组(p0.01)。与之相反,oct-4表达水平在诱导组下降至对照组的19%(p0.01)。与对照组相比,14d、28d、42d时诱导组的组织学染色均显示阳性,显示基体分泌ecm糖胺多糖,14d、28d、42d时诱导组的Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,显示经诱导后基体可产生作为原生自然关节盘组织的主要成分Ⅰ型胶原。压缩实验显示对照组基体的压缩模量均小于相应时间点诱导组基体的压缩模量(p0.05);对于诱导组,42d时基体压缩模量最大。结论:自组装山羊骨髓间充质干细胞纤维软骨基体经生长因子诱导成功构建;基体经诱导后分泌的ecm与自然关节盘相似,体外培养42d时压缩模量最大。第三部分干细胞源性自组装颞下颌关节盘复合基体的力学性能研究;目的:改善并提高干细胞源性自组装基体的力学性能,为成功构建干细胞源性关节盘组织用于临床修复提供细胞组成筛选及力学参数。方法:分别构建干细胞源性自组装基体诱导组(10ng/mltgf-β1,500ng/mlbmp-2,10-7mdex,1×its,50mg/lascorbicacid,40μg/mlproline,100μg/mlpyruvicacid,100u/mlpenicillin/100mg/mlstreptomycin)和共培养组(gbmscs:tmjdisccells=2:1),体外培养42d后,观察和检测自组装gbmscs纤维软骨基体形态、成分变化、基体剖面形貌及基体抗压缩力学性能。结果:体视显微镜镜下观察结果显示除阴性对照组,其余各组基体呈类似规则球体,表面光滑连续,具有光泽感且轻触有回弹;除阴性对照组,其余各组组织学与免疫组织化学染色都成阳性,其中诱导组着色最深。说明各组自组装基体可以分泌GAG及Ⅰ型胶原,且诱导组GAG和Ⅰ型胶原含量较共培养组高。扫描电镜结果显示自组装基体相邻细胞突触接触,细胞呈规则有序层叠排列,其中诱导组可见密集大量纤维同向排列呈一定走向,细胞多为层状重叠分布;共培养组多为层状细胞排列,但仍可见短而细的纤维分布。力学实验结果显示两组抗压缩性能均高于关节盘自组装基体对照组(P0.05),且诱导组抗压缩性能明显高于共培养组(P0.05)。结论:共培养体系构建的自组装基体具有与关节盘细胞自组装基体相似的电镜结构和力学性能,经生长因子诱导后的干细胞自组装基体力学性能明显优于前者,但其压缩性能都不及原生关节盘组织。
【关键词】：山羊骨髓间充质干细胞 组织工程 压缩实验 颞下颌关节盘
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-15
• 第一部分 引言15-21
• 1.1 颞下颌关节盘组织工程15-17
• 1.1.1 组织工程概述15
• 1.1.2 颞下颌关节盘概述15
• 1.1.3 颞下颌关节盘的生物力学性能15-16
• 1.1.4 颞下颌关节盘组织工程的种子细胞16-17
• 1.1.5 工程化颞下颌关节盘的相关研究17
• 1.2 骨髓间充质干细胞17-18
• 1.2.1 间充质干细胞诱导分化相关研究17-18
• 1.3 细胞共培养18-21
• 1.3.1 细胞共培养概述18
• 1.3.2 干细胞在共培养体系中的作用18-19
• 1.3.3 干细胞与软骨细胞共培养相关研究19-21
• 第二部分 不同方法下山羊骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定21-31
• 2.1 概述21
• 2.2 材料与方法21-23
• 2.2.1 实验对象21
• 2.2.2 主要试剂21-22
• 2.2.3 主要设备22
• 2.2.4 主要溶液22-23
• 2.2.5 实验器材23
• 2.3 实验方法23-26
• 2.3.1 gBMSCs分离与培养23-25
• 2.3.2 gBMSCs鉴定25-26
• 2.4 实验结果26-29
• 2.4.1 gBMSCs形态学观察26-28
• 2.4.2 gBMSCs成纤维细胞集落形成单位能力检测28
• 2.4.3 gBMSCs表面标记物表达28-29
• 2.5 讨论29-30
• 2.6 小结30-31
• 第三部分TGF-β1、BMP-2 联合诱导对自组装山羊骨髓间充质干细胞基体的影响31-40
• 3.1 概述31
• 3.2 材料与方法31-32
• 3.2.1 实验对象31
• 3.2.2 主要试剂31-32
• 3.2.3 主要仪器32
• 3.3 实验方法32-35
• 3.3.1 实验分组32
• 3.3.2 实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR, RT-qPCR）检测成纤维软骨相关基因表达32-33
• 3.3.3 自组装山羊骨髓间充质干细胞基体构建及诱导33-34
• 3.3.4 形态学观察34
• 3.3.5 组织学染色34
• 3.3.6 免疫组织化学染色34
• 3.3.7 基体力学性能分析34-35
• 3.3.8 统计学方法35
• 3.4 实验结果35-38
• 3.4.1 实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR, RT-qPCR）检测成纤维软骨相关基因表达35-36
• 3.4.2 形态学观察36
• 3.4.3 组织学染色36-37
• 3.4.4 免疫组织化学染色37
• 3.4.5 基体力学性能分析37-38
• 3.5 讨论38-39
• 3.6 小结39-40
• 第四部分 干细胞源性纤维软骨自组装基体的力学性能研究40-47
• 4.1 概述40
• 4.2 材料与方法40
• 4.2.1 实验对象40
• 4.2.2 主要试剂40
• 4.3 实验材料40
• 4.3.1 实验试剂40
• 4.3.2 实验仪器40
• 4.3.3 主要溶液40
• 4.4 实验方法40-43
• 4.4.1 山羊颞下颌关节盘的分离与细胞培养40-41
• 4.4.2 TMJ disc细胞的传代培养41
• 4.4.3 gBMSCs分离与培养41
• 4.4.4 干细胞源性纤维软骨自组装基体的构建41-42
• 4.4.5 形态学观察42
• 4.4.6 组织学染色42
• 4.4.7 免疫组织化学染色42
• 4.4.8 SEM观察基体剖面结构42
• 4.4.9 基体力学性能分析42-43
• 4.5 实验结果43-45
• 4.5.1 形态观察43
• 4.5.2 组织学染色43-44
• 4.5.3 免疫组织化学染色44
• 4.5.4 SEM观察基体剖面结构44-45
• 4.5.5 基体力学性能分析45
• 4.6 讨论45-46
• 4.7 小结46-47
• 第五部分 结论与展望47-48
• 参考文献48-52
• 在学期间研究成果52-53
• 致谢53-54
• 附录54-63
• 1.1 RT-q PCR实验步骤54-55
• 1.2 实验结果55-63

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