纳米羟基磷灰石珊瑚骨块对临界慢性下颌骨缺损修复的影响

发布时间：2017-10-14 09:09

  本文关键词：纳米羟基磷灰石珊瑚骨块对临界慢性下颌骨缺损修复的影响

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【摘要】：研究背景临床上,牙周病、肿瘤等常会造成较大范围的颌骨缺损,此类缺损一般无法自行修复,需要进行骨移植。自体骨移植是公认的骨缺损修复金标准,但由于来源有限,存在附加损伤、疼痛和感染机会等并发症问题,临床应用常常受限。在众多异体骨移植材料中,羟基磷灰石珊瑚人工骨(hydroxyapatite/coralline, HA/coral),又名珊瑚羟基磷灰石(coralline hydroxyapatite, CHA),是一种通过热液置换的方法将碳酸钙转换成羟基磷灰石的可生物降解人工合成类支架材料,它不仅保留了天然珊瑚的三维网孔结构,还具有羟基磷灰石良好的生物相容性、机械强度、骨传导性等等。有研究显示：颗粒型CHA在牙周组织再生中能提高牙周韧带细胞(periodontal ligament cell, PDLC)的附着；还有学者对其成骨机制和成骨效能进行研究,发现成骨细胞和胶原骨基质沿颗粒间隙包绕成骨,成骨均一且成骨效能良好。目前,颗粒型CHA常常被应用于牙周和种植外科的引导骨组织再生中。但是,对于较大范围的颌骨缺损修复来说,颗粒型珊瑚羟基磷灰石容易受咀嚼等外力作用发生形变,形态和空间维持方面欠理想；相比之下,羟基磷灰石珊瑚骨块易塑形,空间维持能力强,大小不受限,甚至可根据缺损形状进行定制。尽管珊瑚羟基磷灰石骨块可以克服颗粒型珊瑚羟基磷灰石的上述诸多不足,但至今仍未能在临床上广泛应用,因为有研究发现：块状骨移植的成骨效果比颗粒状的效果差。还有研究认为,大范围骨缺损常伴随受区血运欠佳,即便使用了理想的支架材料,也会由于骨块中心部位营养和氧气缺乏而影响血管和骨组织的新生,造成缺损中心和外周成骨不均,严重者甚至会出现坏死。因此,如何提高骨块移植的血管新生是羟基磷灰石珊瑚骨块是否能得到广泛应用的关键。众所周知,骨组织缺损修复是一个涉及到血块机化、成骨细胞和巨噬细胞向伤处迁移、增殖、分化以及血管和编织骨新生的一系列复杂过程。其中,血管生成是骨组织愈合早期的重要因素。因此,支架血管化被认为是缺损修复中骨移植的关键环节和重要手段。在组织工程中,支架血管化处理方法有很多,包括干细胞移植法、联合基因转染细胞移植法和生长因子复合法等等。其中生长因子复合法是通过组织工程的方法将生长因子吸附于支架上,利用其缓释载体作用进而实现支架的血管化。在诸多生长因子中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种特异性作用于血管内皮细胞的强效多功能细胞生长因子,不仅能在血管生成初期高度特异性的促进内皮细胞有丝分裂,诱导细胞迁移、增殖,分化为血管内皮细胞,控制细胞凋亡,改善新生血管的形成,同时还能上调骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)的表达,诱导成骨细胞迁移、增殖、分化,促进新骨生成。当然,单纯的VEGF极易在局部降解,很难在较长时间内发挥生物学作用,需要通过支架材料作为载体缓慢释放。羟基磷灰石珊瑚骨块中的羟基磷灰石具有非共价吸附血管内皮生长因子的功能基团如：-OH,-NH2,-COOH-;同时,其开放连通的不规则多孔结构和理想的孔径大小能增加支架的表面积,有利于生长因子的缓释。因此,以珊瑚羟基磷灰石骨块为支架材料,通过物理吸附的方法复合血管内皮生长因子。纳米支架材料在骨组织工程中不断受到关注,纳米级的羟基磷灰石能模拟天然骨的结构和组成,有助于人体细胞及生物大分子对其识别；能于机体内与胶原蛋白末端的氨基键合,形成具有特定生物活性的化学键合界面,具备与骨键合的能力；能为成骨细胞的黏附、胶原和骨盐的沉积提供了适合的微环境；同时,与微米级羟基磷灰石相比,纳米级羟基磷灰石的表面积明显增加,更有利于骨细胞在材料表面粘附、迁移和生物矿化；此外,纳米级羟基磷灰石能够促进钙磷沉积和类骨质的矿化。目前,国内外关于纳米羟基磷灰石珊瑚骨块修复颌骨缺损的研究甚少,关于其支架复合血管内皮生长因子的研究尚无报道,纳米羟基磷灰石珊瑚骨块是否能在临床上广泛应用于颌骨缺损修复仍需深入研究。本研究建立临界慢性下颌骨缺损动物模型,旨在通过纳米羟基磷灰石珊瑚骨块移植的动物实验探索其成骨机制和成骨效能；并将血管内皮生长因子复合在纳米羟基磷灰石珊瑚骨块后移植于临界慢性下颌骨缺损,观察其血管和骨组织新生的改善情况,旨在提高骨块移植的血运和成骨,为纳米羟基磷灰石珊瑚骨块在临床上广泛应用提供理论依据。目的1.研究纳米羟基磷灰石珊瑚骨块移植成骨机制和成骨效能。2.研究血管内皮生长因子对纳米羟基磷灰石珊瑚骨块修复临界慢性下颌骨缺损的促血管和骨组织新生作用。方法1.利用扫描电镜检测商业珊瑚骨块、商业纳米羟基磷灰石珊瑚骨块、人类皮质骨块、人类松质骨块,研究其表面形貌、孔径、微观晶体形态和直径；通过能谱分析检测nHA/coral骨块表面化学元素含量；采用X-射线衍射(X-ray diffraction,XRD)检测和物相分析研究nHA/coral骨块的表面晶相。2.室温下在超净工作台上将rhVEGF165溶解在无菌PBS缓冲液中,配制成12ug/ml VEGF/PBS溶液。将16块纳米羟基磷灰石／珊瑚骨块独立摆放于无菌培养皿上,将0.25毫升rhVEGF165溶液注射于骨块内(3μg rhVEGF165/骨块),非共价的物理吸附rhVEGF165;将另外16块纳米羟基磷灰石／珊瑚骨块注射等量无菌PBS缓冲液。静置半小时后低温无菌下保存。3.复合血管内皮生长因子的纳米羟基磷灰石／珊瑚骨块修复临界慢性下颌骨缺损的动物实验(1)动物实验分为VEGF/nHA/coral和nHA/coral两组,VEGF/nHA/coral组为实验组,nHA/coral组为对照组。每组设3周、8周两个观察时间点。每只动物随机标号,并于每侧下颌骨建立四个标准化临界慢性骨缺损,采用半口对照设计,随机将VEGF/nHA/coral骨块植于一侧缺损中,将nHA/coral骨块植于另一侧。(2)建立临界慢性下颌骨缺损模型。手术分为两个阶段。首先全麻下采用分根法拔除双侧下颌第二,三,四前磨牙以及第一和第二磨牙(P2-M2),沿牙槽嵴顶纵向切开粘骨膜,翻瓣,0.9%无菌生理盐水冷却下于双侧下颌骨的颊侧制出四个标准化箱型临界骨缺损(n=8),大小6x9x12毫米3(颊舌向距离为6mm,牙合龈向距离9mm,近远中向距离为12mm),缺损间隔4毫米；完整保留舌侧骨板,粘骨膜瓣复位,丝线间断缝合。然后,术后8周时,全麻下重新沿牙槽嵴顶纵向切开粘骨膜,翻瓣,对箱型慢性骨缺损进行重新塑形,按照半口对照设计,将16块纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块和16块VEGF/纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块组分别植入骨缺损内,制作减张切口,粘骨膜瓣复位,丝线间断缝合。(3)3周、8周处死动物,对骨块及相邻骨组织进行组织学、免疫组织化学观察和组织形态学测量分析。制作脱钙切片,进行HE染色、Masson染色和vWF免疫组化染色,通过HE染色法观察3、8周骨缺损修复中骨细胞、血管和骨基质的生成情况,利用IPP软件测量新生骨面积百分比,对照组和实验组样本量均为8个；通过Masson染色法观察3、8周骨缺损修复中骨胶原基质的分泌情况；利用vWF免疫组化染色法研究血管新生情况,通过IPP软件检测新生血管密度,对照组和实验组样本量均为8个。制作硬组织切片,采用双荧光标记法通过共聚焦显微镜观察不同荧光标记时间点的新骨生成情况以及骨块降解情况,利用IPP软件测量钙化新生骨面积比,对照组和实验组样本量均为8个；通过甲苯胺蓝染色法研究实验组和对照组骨块移植不同观察时间点的新骨生成情况。4.采用SPSS 18.0统计分析软件,对硬组织切片荧光标记的钙化新生骨面积比、脱钙切片HE染色的新生骨面积百分比、vWF免疫组化染色的新生血管密度数据进行统计分析。上述测量结果均以平均值±标准差来表示,首先对组织形态学测量数据进行正态分布和方差齐性检验,若满足正态分布和方差齐则以2×2析因设计的方差分析来检测处理因素的主效应和时间的交互作用。对于单独处理效应的分析,若满足正态分布和方差齐则利用两独立样本t检验进行整体均数的比较；若不满足正态分布或方差不齐则采用两独立样本t'检验比较整体均数。假设检验为双侧检验,检验水准P=0.05。当P0.05时,差异被认为无统计学意义；当P0.05时,差异被认为具有统计学意义。结果1. coral骨块、nHA/coral骨块、人类皮质骨和松质骨的微观粗糙表面相类似,多孔结构相互连通,其孔径大小在62-164μm范围内；在nHA/coral骨块表面均匀分布着指状的直径为71-99nm的羟基磷灰石晶体,与人类皮质骨和松质骨的纳米级结构非常类似。能谱分析结果显示nHA/coral骨块含有的化学元素主要为钙、碳、氧、磷。XRD检测结果证实nHA/coral骨块的表面晶体成分为羟基磷灰石和碳酸钙。2.纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块具有良好的浸润性,0.25毫升12ug/mlVEGF/PBS溶液恰好完全浸润整个骨块,单个nHA/coral骨块内含3μg rhVEGF165。3.复合血管内皮生长因子的纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块修复临界慢性下颌骨缺损的动物实验(1)大体观察结果显示：术后4只比格犬均无死亡,饮食、活动正常,下颌骨移植术区无红肿、化脓,无骨块松动脱落等并发症；3周、8周后,大体标本见植骨区愈合良好,骨生长良好,植骨区与宿主骨边界较清晰。(2)脱钙切片HE染色组织学观察和组织形态学分析3周时nHA/coral组在骨缺损区近宿主骨-骨块交界处可见有稀疏骨小梁和伴行的血管结构,并沿着支架向网孔内部生长,骨块内部新骨和血管与界面处相比明显较少,在支架中央几乎无新生组织长入,少见炎症细胞浸润。在新生血管结构中,大量的血管内皮细胞环状排列形成的新生血管和管内的血细胞清晰可见；在新骨小梁结构中还能见沿着脱钙的支架网孔间隙有线形排列的成骨细胞呈多形性,增生活跃。而VEGF/nHA/coral组的新生骨组织结构、分布与nHA/coral组相类似,数量相对较多。8周时随着观察时间的增长,两组新骨和血管生成均明显增多,不仅在骨块的外周可见大量的新生组织,在支架内部很容易发现新生骨组织和血管系统,骨小梁明显增宽,并在局部出现少量的板层骨结构。VEGF/nHA/coral组的支架内的新生组织情况与nHA/coral组相类似,数量相对略多。组织形态学测量结果显示：nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组的新生骨面积百分比分别为21.7±4.6%和27.3±5.8%；nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组的新生骨面积百分比分别为32.6±7.2%和39.3±7.8%。析因设计方差分析提示分组与时间之间不存在交互作用(P=0.815),即nHA/coral组与VEGF/nHA/coral组的差异在3w和8w均一样。3周统计数据符合正态分布,Levene's test检查方差齐性；独立样本t检验结果为：t=2.103,P=0.0540.05,差异无统计学意义。8周统计数据符合正态分布,Levene's test检查方差齐性；独立样本t检验结果为：t=1.764,P=0.0990.05,无显著性差异。在nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组内,8周新生骨面积比均显著高于3周,其中nHA/coral组内独立样本t检验结果为：t=3.577,P=0.0030.01；VEGF/nHA/coral组内独立样本t检验结果为：t=3.453,P=0.0030.01。(3)脱钙切片Masson染色组织学观察3周时nHA/coral组,新生骨小梁结构可见新生骨胶原纤维排列稍为紊乱,结构尚未成熟,呈浅蓝色；而VEGF/nHA/coral组新生骨胶原纤维相对成熟,排整齐；类骨质包绕成骨细胞形成骨细胞,形成骨陷窝,有钙盐沉积的骨细胞及骨陷窝结构呈现蓝染。8周时nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组均可见蓝色的骨细胞和骨样组织以及成熟的骨性胶原纤维排列整齐而致密,成熟的新生骨组织胶原分布均明显增宽增多,有部分编织骨形成,红蓝相间。(4)脱钙切片vWF免疫组化染色和测量vWF为血管壁上血管内皮细胞的标记物,其阳性着色区域代表血管。在不同时间观察点的各组可见新生血管的分布于新骨相似,均存在边缘血管生成明显,而中心部位相对较少的现象。3周时,nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组的vWF阳性表达区域均主要分布在骨块-宿主骨交界处,呈现大小不一的椭圆形,棕褐色着色；而在骨块内部棕褐色阳性表达明显减少,在中央部位几乎未见vWF阳性表达。VEGF/nHA/coral组的阳性表达区域略多,nHA/coral组则相对较少。8周时,随着骨愈合时间增加,两组的新生血管数量均有显著增加,不仅是在骨块外周区域,而且在支架内部也明显发现阳性表达区域的增加。nHA/coral组则较少,而VEGF/nHA/coral组的阳性表达区域则相对较多。组织形态学测量结果显示：VEGF/nHA/coral组的新生血管密度为146±32.6个/mm2,显著高于nHA/coral组(105±31.4个/mm2)。nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组的新生血管密度分别增至269±66.6和341±70.8个/mm2。析因设计方差分析提示分组与时间之间不存在交互作用(P=0.419),即VEGF/nHA/coral组与nHA/coral组的差异在3w和8w均一样。3周统计数据符合正态分布,Levene's test检查方差齐性；独立样本t检验结果为：t=2.56,P=0.0230.05,差异有统计学意义。8周统计数据符合正态分布,Levene's test检查方差齐性；独立样本t检验结果为：t=2.098,P=0.0550.05,无显著性差异。nHA/coral和VEGF/nHA/coral组内8周新生血管密度均显著高于3周,其中nHA/coral组内独立样本t检验结果为：t=6.303,P=0.0010.01；VEGF/nHA/coral组内独立样本t检验结果为：t=7.081,P=0.0010.01。(5)不脱钙硬组织切片双荧光组织学观察和组织形态测量新生骨螯合荧光剂而显示绿色(钙黄绿素)和黄色(盐酸四环素)。3周时nHA/coral组绿色钙黄绿素荧光明显呈现网状,主要分布在支架周边尤其是近宿主骨-支架界面处,而在骨块内部也不均匀的分布有少量绿色荧光。在近宿主骨-支架界面处见少量黄色四环素荧光呈条带状；而VEGF/nHA/coral组绿色钙黄绿素荧光带相对较多,骨块内部明显可见分布不均的绿色荧光。绿色荧光带不仅包绕于网孔结构的材料表面,还有部分进入到网孔状空间内。两组的支架形态均较规则,未见明显吸收情况。8周时两组黄色和绿色荧光标记的新骨在支架周边和内部均明显增多,黄色四环素荧光在支架内不同部位均有显现。相比之下VEGF/nHA/coral组的荧光带明显多于nHA/coral组。两组的支架形态仍较规则,除了在支架的孔壁结构中发现气泡状的二级孔结构改变之外,基本未发现明显的支架形态改变。组织形态学测量结果显示：nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组的钙化新生骨面积比分别为0.79±0.22%和1.08±0.29%；VEGF/nHA/coral组和nHA/coral组的钙化新生骨面积比分别为4.25±1.14%和5.21±1.07%。析因设计方差分析提示分组与时间之间不存在交互作用(P=0.248),即nHA/coral组与VEGF/nHA/coral组的差异在3w和8w均一样。3周统计数据符合正态分布,Levene's test检查方差齐性；独立样本t检验结果为：t=2.199,P=0.0450.05,差异有统计学意义。8周统计数据符合正态分布,Levene's test检查方差齐性；独立样本t检验结果为：t=1.725,P=0.1070.05,无显著性差异。nHA/coral和VEGF/nHA/coral组内8周钙化新生骨面积比显著高于3周,nHA/coral组内独立样本t'检验结果为：t'=8.43,P=0.0010.01；VEGF/nHA/coral组内独立样本t'检验结果为：t'=10.497,P=0.0010.01。(6)不脱钙硬组织切片甲苯胺蓝染色组织学观察在3周、8周两组支架形态规则,均未见明显降解。3周时实验组和对照组在与宿主骨相接处的支架外围均成骨明显,而支架中心部位染色区域较少。8周时两组新骨生成均明显增多,有其是支架内部成骨明显,但是仍存在边缘和中心成骨不均匀的现象。结论1.纳米羟基磷灰石珊瑚骨块具有与天然骨组织相似的粗糙表面、化学成分、纳米级微观结构；同时具有理想的三维网孔结构,是符合骨组织工程要求的理想支架材料。2.纳米羟基磷灰石珊瑚骨块在临界慢性颌骨缺损修复中理想的三维网孔结构可以使细胞能通过网孔结构进入支架内部进而形成血管和骨组织新生,并表现出具有良好的生物相容性、生物降解性、骨诱导性和骨传导性,具有较高的成骨效能。3.血管内皮生长因子能在骨愈合早期提高纳米羟基磷灰石珊瑚骨块移植的血管新生,促进新骨钙化,但不能在整个骨愈合过程中直接提高新骨生成比例。
【关键词】：纳米羟基磷灰石 珊瑚 骨移植 血管内皮生长因子 组织工程 支架
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R782.4
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-35
• 第一章 纳米羟基磷灰石珊瑚骨块的理化性质检测35-47
• 1.1 材料与方法35-37
• 1.2 结果37-43
• 1.3 讨论43-46
• 小结46-47
• 第二章 血管内皮生长因子对纳米羟基磷灰石珊瑚骨块修复临界慢性下颌骨缺损影响的动物实验47-90
• 2.1 材料和方法48-67
• 2.2 结果67-79
• 2.3 讨论79-89
• 小结89-90
• 参考文献90-103
• 全文总结103-104
• 中英文对照缩略词表104-105
• 成果105-106
• 致谢106-109
• 统计学证明109

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本文编号：1030187