纳米羟基磷灰石复合电纺纤维膜诱导牙周膜细胞骨化分化的研究

发布时间：2017-10-14 09:27

  本文关键词：纳米羟基磷灰石复合电纺纤维膜诱导牙周膜细胞骨化分化的研究

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【摘要】：牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病,会破坏牙周支持组织,并最终导致牙体脱落。牙周治疗的最终目标是牙周支持组织再生、形成牙周新附着,而修复破坏的牙槽骨则是建立牙周新附着的重要条件。骨修复是牙周组织再生修复的基本条件,采用具有诱导组织再生性能的生物材料辅以合适的负载支架是诱导牙周组织再生治疗的重要目标。近年来,随着纳米知识与技术的不断发展,人们发现人体骨骼中的羟基磷灰石是以纳米级针状单晶体形式,均匀地分布于胶原纤维束中,形成无机-有机复合材料。因此,在含胶原蛋白纤维中直接引入、或在低温条件下对其进行原位矿化,以形成纳米羟基磷灰石在含胶原纤维内部及表面的镶嵌,成为制备仿生支架的有效方法。本文就nHA复合电纺纤维支架材料对牙周膜细胞的诱导作用进行了研究,为其应用于诱导骨组织再生奠定基础。实验一Ⅰ型胶原蛋白/聚己内酯/纳米羟基磷灰石仿生矿化材料的制备及表征目的：制备Ⅰ型胶原蛋白/聚己内酯/纳米羟基磷灰石仿生矿化材料,并表征其相关理化性能。方法：采用静电纺丝技术制备Ⅰ型胶原蛋白/聚己内酯/纳米羟基磷灰石(COL/PCL/nHA),并将其置于模拟体液(Simulated body fluid, SBF)中浸泡7日得到Ⅰ型胶原蛋白/聚己内酯/纳米羟基磷灰石仿生矿化材料(COL/PCL/nHA-SBF).采用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope, SEM)、能量色散X射线光谱分析技术(Energy-dispersive X-ray fluorescenceanalysis, EDX)、X射线衍射分析技术(X-ray diffraction analysis, XRD)、水接触角分析技术(Water contact angle analysis, WCA)对材料及对照组进行表征。结果：SEM见各组纤维呈无规则排列,粗细较为均匀,纤维之间相互交错形成网状结构,纤维直径约300-400nm之间,表明nHA的掺入对纤维直径的变化无明显影响。Ⅰ型胶原蛋白／聚己内酯(COL/PCL)纤维均匀光滑,而COL/PCL/nHA纤维内由于包裹颗粒使表面呈粗糙外观,EDX和XRD结果表明该颗粒即为羟基磷灰石；且在复合材料制备过程中,HA的元素成分及晶体结构无明显变化。高倍电镜下见COL/PCL/nHA-SBF纤维表面有颗粒沉积,EDX和XRD结果表明该沉积物的元素构成及晶体结构与羟基磷灰石十分相似。此外,nHA的混纺和矿化沉积亦提高了材料的亲水性能。结论：采用静电纺丝结合体外SBF仿生矿化技术成功制备出COL/PCL/nHA-SBF,纤维内部包裹的nHA颗粒向外突起,纤维表面有羟基磷灰石纳米颗粒沉积；且材料具有良好的亲水性能。实验二人牙周膜细胞体外分离培养与鉴定目的：体外分离培养人牙周膜细胞(Periodontal ligament cell, PDLC)并对其进行来源鉴定。方法：采用组织块法体外分离培养PDLC。对分离得到的细胞进行抗人波形蛋白和抗人角蛋白免疫组织化学染色,以鉴定其组织来源。结果：原代培养10日时,细胞逐渐从组织块周边爬出、游走、贴壁生长并进行增殖。原代培养20日时,细胞增殖活跃并发生融合,细胞可铺满瓶底90%。传代培养PDLC,细胞生长排列成束、漩涡状,有明显的方向性。第四代细胞免疫组织化学染色结果：波形蛋白在细胞中呈阳性表达(胞浆呈棕褐色),角蛋白染色阴性,说明其为中胚层来源细胞。结论：采用组织块法成功分离培养PDLC,免疫组织化学染色鉴定其为中胚层来源细胞。实验三Ⅰ型胶原蛋白／聚己内酯／纳米羟基磷灰石仿生矿化材料生物相容性及骨化诱导潜能的研究目的：评价Ⅰ型胶原蛋白／聚己内酯/纳米羟基磷灰石仿生矿化材料的生物相容性及骨化诱导潜能。方法：将原代分离培养的PDLC接种于COL/PCL/nHA-SBF及对照组,培养一定时间后采用SEM、共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope, CLSM)观察材料表面细胞形貌及细胞骨架系统。采用细胞计数试剂盒(Cell counting kit, CCK8)检测细胞在各组材料表面的增殖情况；采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction, QPCR)检测材料表面细胞中,成骨分化标志分子碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP), Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2, Runx2),骨钙蛋白(Osteocalcin, OCN),骨桥蛋白(osteopontin, OPN)的表达情况。结果：SEM结果表明,COL/PCL/nHA-SBF表面PDLC具有良好的生长活性,细胞表面有纤毛、伪足伸出,并可见细胞外基质的分泌。CLSM则可见细胞骨架肌动蛋白丝分布致密,细胞在材料表面生长融合成片。CCK8检测提示,细胞在各组材料表面均能够随着培养时间的延长而稳定增殖,各组间增殖情况无明显差异。PDLC与各组材料培养14日后,QPCR检测结果显示COL/PCL/nHA-SBF可促进PDLC的成骨分化标志分子Runx2, OCN, OPN表达上调,从而初步启动骨化过程。结论：COL/PCL/nHA-SBF有利于细胞的黏附与生长,并具有良好的生物相容性及一定的骨化诱导潜能。综上所述,本研究采用静电纺丝技术制备出COL/PCL/nHA-SBF复合材料,并通过体外实验初步验证了其具备良好的生物相容性及骨化诱导潜能,为进一步研究该复合材料作为牙周组织工程支架材料的意义提供依据。
【关键词】：静电纺丝 纳米羟基磷灰石 牙周膜细胞
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.4
【目录】：

• 前言5-7
• 摘要7-10
• abstract10-14
• 主要英文缩略语索引14-15
• 绪论15-20
• 实验一 I型胶原蛋白/聚己内醋/纳米哲基zi巧石仿生矿化材料的制备及表征20-30
• —、材料20-21
• 二、方法21-22
• 三、结果22-26
• 四、讨论26-29
• 五、结论29-30
• 实验二 人牙周膜细胞体外分离培养与鉴定30-35
• 一、材料30
• 二、方法30-32
• 三、结果32
• 四、讨论32-34
• 五、结论34-35
• 实验三 I型胶原蛋白/聚己内酯/纳米羟基磷灰石仿生矿化材料生物相容性及骨化诱导潜能的研究35-45
• 一、材料35-36
• 二、方法36-39
• 三、结果39-42
• 四、结论42-44
• 五、结论44-45
• 全文小结45-46
• 参考文献46-54
• 攻读学位期间发表论文情况54-55
• 致谢55-56
• 附录56-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：1030305