曲古抑菌素A在人牙龈干细胞炎症反应中的作用及机制研究

发布时间：2017-10-17 00:25

  本文关键词：曲古抑菌素A在人牙龈干细胞炎症反应中的作用及机制研究

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【摘要】：目的:本研究拟采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂,曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)改变人牙龈干细胞组蛋白乙酰化修饰状态,观察牙龈干细胞炎症性细胞因子的表达及分子调控机制,提供新型的药物治疗牙周炎及种植体周围炎。方法:1.人牙龈干细胞的体外分离培养及生物学鉴定牙周炎疾病患者和无牙周疾病的健康人群的牙龈组织,通过酶对牙龈组织进行消化,分离培养人牙龈干细胞。选取生长良好的第三代人细胞,通过流式细胞术检测并分析人牙龈干细胞相关表面抗原OTC-4、SSEA-4、CD146和CD90的表达,并对牙龈干细胞进行成骨诱导,通过碱性磷酸酶(ALP)染色、碱磷酶(ALP)活性检测鉴定早期成骨分化,通过茜素红染色以及钙结节定量分析鉴定晚期成骨分化。通过成脂诱导后,进行油红O染色,检测干细胞的成脂分化能力。2.HDAC抑制剂TSA对炎症环境下牙龈干细胞炎性细胞因子的抑制作用通过RT-PCR方法,检测组蛋白去乙酰化酶HDACⅠ、Ⅲ、Ⅳ及炎性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α在健康及炎症牙龈干细胞中的表达情况。不同浓度的TSA作用于人牙龈干细胞,通过MTT和Annexin V法检测牙龈干细胞的增殖和凋亡的影响,确定TSA的最佳浓度;流式CBA法检测TSA对炎症微环境下牙龈干细胞胞外分泌炎性细胞因子的抑制作用;加入TSA刺激后,RT-PCR法检测正常及炎症牙龈干细胞中IL-6、IL-8的表达。3.HDAC抑制剂调节炎性细胞因子的分子机制牙龈干细胞经LPS及TSA刺激后的0,15,30,45,60分钟提取总蛋白及核蛋白,通过NF-ΚB(p65)转录因子检测试剂盒对p65的活性进行检测,Western-blot法检测I-κB、pI-κB、p65、p-p65蛋白的表达,并进行统计学分析。结果:1.使用Ⅰ型胶原酶和Dispase酶消化得到人健康和炎症环境下的牙龈干细胞,显微镜下进行观察,发现细胞呈体积短小,呈短梭形。流式细胞术检测人牙龈干细胞的表面抗原OTC-4、SSEA-4、CD146、CD90呈阳性表达。经成骨诱导的作用下,7天后,ALP染色结果可见细胞蓝染,诱导21天茜素红染色,镜橘红色的钙结节。经过成脂诱导28天后镜下观察可以见到折射点,经油红O染色后,这些折射点呈橙红色。2.RT-PCR凝胶电泳结果显示,HDACⅠ,Ⅲ,Ⅳ和炎性细胞因子IL-6、IL-8在炎症人牙龈干细胞中的表达较健康干细胞表达增加。增殖和凋亡检测,确定TSA的最佳浓度为100 nM,加入100 nM TSA于LPS诱导的实验组,RT-PCR检测发现,牙龈干细胞中IL-6、IL-8 mRNA在TSA刺激后表达显著下降,细胞培养上清液中IL-6、IL-8在100 nM TSA刺激后显著降低(P0.05)。3.NF-κB(p65)转录因子检测试剂盒检测p65转录活性,发现加入LPS后p65活性增高,加入TSA后p65活性降低,并在30分钟时活性p65活性最高。Western-blot检测发现LPS刺激后胞浆中磷酸化的I-κB和胞核中磷酸化的p65表达增加,加入100 nM TSA刺激后,胞浆中的I-κB和胞核中的p65磷酸化水平显著降低。结论:1.健康及炎症牙龈组织中存在干细胞,其表达干细胞标志物OCT-4、CD146、CD90和SSEA-4,且具有多向分化潜能;2.组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA能够抑制炎症环境下牙龈干细胞炎性细胞因子的分泌;3.TSA抑制牙龈干细胞炎性细胞因子分泌,可能与其抑制NF-κB信号通路有关;
【关键词】：牙龈干细胞 组蛋白去乙酰化酶 曲古抑菌素A NF-κB信号通路 炎性细胞因子
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.4
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-13
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 一、人牙龈干细胞体外培养及鉴定13-22
• 1.1 对象和方法13-16
• 1.1.1 实验仪器及设备13-14
• 1.1.2 牙龈组织收集14
• 1.1.3 人牙龈干细胞原代分离培养14-15
• 1.1.4 倒置显微镜观察15
• 1.1.5 流式细胞术检测牙龈干细胞表面抗原标志物15
• 1.1.6 体外成骨诱导及检测15-16
• 1.1.7 体外成脂诱导及染色16
• 1.2 结果16-20
• 1.2.1 显微镜下观察细胞的形态16-17
• 1.2.2 流式细胞术检测GMSCs表达干细胞表面标志物17
• 1.2.3 GMSCs经体外成骨诱导分化碱性磷酸酶染色阳性17-18
• 1.2.4 GMSCs经体外成骨诱导分化碱性磷酸酶活性检测阳性18
• 1.2.5 GMSCs体外成骨诱导分化具有矿化结节的能力18-19
• 1.2.6 GMSCs体外成脂诱导后油红O染色呈阳性19-20
• 1.3 讨论20-21
• 1.4 小结21-22
• 二、曲古抑菌素A对炎症环境下牙龈干细胞中炎性细胞因子的抑制作用22-36
• 2.1 对象和方法22-27
• 2.1.1 主要的实验设备22
• 2.1.2 半定量RT-PCR检测HDACⅠ、Ⅲ、Ⅳ及炎症因子的表达22-24
• 2.1.3 MTT法检测不同浓度TSA对GMSCs的增殖影响24
• 2.1.4 流式细胞术Annexin V检测不同浓度TSA对GMSCs凋亡影响24-25
• 2.1.5 半定量RT-PCR检测TSA在炎症微环境下对GMSCs炎性因子的作用25
• 2.1.6 流式细胞术CBA法检测TSA在炎症微环境下对GMSC炎性因子的作用25-27
• 2.2 结果27-33
• 2.2.1 HDACⅠ、Ⅲ、Ⅳ与炎症因子IL-6、IL-8 在N-GMSC和I-GMSC中表达有差异27-28
• 2.2.2 MTT检测 100 nM的TSA对GMSC增殖的影响28-29
• 2.2.3 流式细胞术Annexin V检测 100 nM的TSA对GMSC凋亡的影响29
• 2.2.4 半定量RT-PCR检测TSA抑制炎性微环境下GMSC中IL-6、IL-8mRNA的表达29-31
• 2.2.5 流式细胞术CBA法检测TSA抑制炎症微环境下GMSC中炎症因子的表达31-33
• 2.3 讨论33-34
• 2.4 小结34-36
• 三、曲古抑菌素A调节炎性细胞因子的分子机制36-45
• 3.1 对象和方法36-41
• 3.1.0 主要的实验试剂及设备36
• 3.1.1 NF-κB(p65) DNA结合活性检测TSA对炎症环境下GMSC中p65的转录活性的作用36-39
• 3.1.2 免疫荧光显微镜检测TSA对炎症环境下p65的转录活性39-41
• 3.2 结果41-43
• 3.2.1 TSA抑制炎症环境下GMSC中p65入核的转录活性41-42
• 3.2.2 TSA抑制炎症环境下GNSC中p65和I-κB磷酸化42-43
• 3.3 讨论43-44
• 3.4 小结44-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 发表论文和参加科研情况说明50-52
• 综述 组蛋白去乙酰化酶及抑制剂对慢性炎症性疾病中作用的研究进展52-60
• 综述参考文献56-60
• 致谢60

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本文编号：1045779