载BMP2质粒DNA的壳聚糖温敏水凝胶对牙周膜成纤维细胞相容性的评价

发布时间：2017-11-01 05:26

  本文关键词：载BMP2质粒DNA的壳聚糖温敏水凝胶对牙周膜成纤维细胞相容性的评价

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【摘要】：目的:本项目拟制备物理交联壳聚糖-甘油磷酸温敏水凝胶(CS/α,β-GP)负载含有骨形态发生蛋白2质粒DNA的壳聚糖纳米粒CSn(pDNA-BMP2),将其与CS/α,β-GP温敏水凝胶复合,构建CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合修复体系。研究该体系对人牙周成纤维细胞(HPDLCs)的细胞相容性。方法:一、载BMP2质粒DNA的壳聚糖纳米粒(CSn(pDNA-BMP2))的制备及性质检测:成功构建pDNA-BMP2质粒表达载体;采用离子交联法制备载BMP2质粒DNA壳聚糖纳米粒CSn(pDNA-BMP2);采用扫描电镜观察形态;zeta电位仪测定粒径、分散度、Zeta电位;应用琼脂凝胶阻滞法分析CSn载体与pDNA-BMP2的结合能力及电荷性质;运用酶保护法测定CSn载体对pDNA-BMP2的保护作用。二、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP体系的构建及性质检测:(1)CS/α,β-GP温敏水凝胶的制备:采用物理交联的方法制备CS/α,β-GP温敏水凝胶;扫描电镜下观察其微观形态;试管倒置法测定其温敏性。(2)CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP体系的构建:取适量的CSn(pDNA-BMP2)磁力搅拌下分散于CS/α,β-GP温敏水凝胶溶液中,构建载CSn(pDNA-BMP2)的CS/α,β-GP温敏水凝胶体系,即CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系;扫描电镜下观察其微观形态;试管倒置法测定其温敏性。三、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP对HPDLCs细胞相容性的评价:(1)原代培养HPDLCs,并鉴定组织来源。(2)HPDLCs在CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系中三维培养,观察细胞形态及增殖情况。(3)将HPDLCs在CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系浸提液中培养,CCK8法检测细胞增殖情况;采用SPSS18.0统计软件处理所得数据。结果:一、CSn(pDNA-BMP2)的制备及性质检测结果:(1)空白CSn及CSn(pDNA-BMP2)电镜下观察,呈球形,粒径均一;CSn(pDNA-BMP2)粒径较空白CSn略大。(2)CSn的平均粒径为170nm,PDI为0.249,Zeta电位为45.5mv。CSn(pDNA-BMP2)平均粒径为270.1nm,PDI为0.486,Zeta电位为27.0mv。(3)琼脂凝胶电泳分析显示,由于中和了质粒DNA所带的负电荷,电泳时质粒不出孔,而裸质粒pDNA-BMP2出孔,证明CSn能有效地结合pDNA-BMP2;(4)酶保护实验显示,裸质粒pDNA-BMP2及N/P为0.5:1的孔内显示空白无条带,而CSn(pDNA-BMP2)在N/P为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1时,则仍为白色。证明CSn(pDNA-BMP2)在N/P为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1时,可以有效保护pDNA-BMP2免受酶的降解。二、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系的构建及性质检测结果:(1)试管倒置法显示CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系均可在37℃下3 min内由可流动的溶胶状态转变为不可流动的凝胶状态;(2)扫描电镜显示,复合体系为多孔的交联网状结构且CSn(pDNA-BMP2)能均匀分散于水凝胶支架的三维网状结构中。三、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP对HPDLCs细胞相容性的评价结果:(1)成功原代培养HPDLCs,免疫组织化学结果显示,培养的细胞HPDLCs波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,证明细胞来源于外胚层。(2)结晶紫染色显示,HPDLCs在CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系中形态良好,48h后开始扩增。(3)CCK8实验结果显示,不同浓度的CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体系浸提液在1d和3d时均能促进HPDLCs的增殖,且CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体系浸提液培养的HPDLCs较CS-α,β-GP温敏水凝胶浸提液培养的的细胞增殖更快。结论:(1)CSn具有良好的形态、粒径及电位。(2)CSn能有效结合和保护pDNA-BMP2,CS/CSn(pDNA-BMP2)在N/P为2.5:1时具有最好的形态、粒径及电位。(3)CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系具有温敏性及大孔径,促进HPDLCs的生长和增殖,具备良好的细胞相容性。
【关键词】：骨形成蛋白-2 壳聚糖 壳聚糖纳米粒 壳聚糖温敏水凝胶 人牙周成纤维细胞
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.4
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-11
• 实验一 负载骨形成蛋白-2 质粒DNA的壳聚糖纳米粒制备及性质检测11-20
• 1.1 材料与设备11-12
• 1.2 实验方法12-14
• 1.3 结果14-17
• 1.4 讨论17-20
• 实验二 载质粒DNA纳米粒的壳聚糖温敏水凝胶复合体系的构建及性质检测20-26
• 2.1 材料与设备20-21
• 2.2 实验方法21-22
• 2.3 结果22-24
• 2.4 讨论24-26
• 实验三 载质粒DNA纳米粒的壳聚糖温敏水凝胶复合体系对牙周膜成纤维细胞相容性的评价26-36
• 3.1 材料与设备26-27
• 3.2 实验方法27-29
• 3.3 结果29-35
• 3.4 讨论35-36
• 结论36-37
• 参考文献37-41
• 综述41-51
• 参考文献48-51
• 攻读学位期间的研究成果51-52
• 致谢52-53

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本文编号：1125461