分化转录相关因子Hey1在成牙本质细胞样细胞发生中的作用及其机制的初步研究

发布时间：2017-11-05 23:29

  本文关键词：分化转录相关因子Hey1在成牙本质细胞样细胞发生中的作用及其机制的初步研究

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【摘要】：成牙本质细胞是单层排列于牙髓组织最外层的高度分化细胞。成牙本质细胞的主要功能是生成构成牙体硬组织最主要部分的牙本质。当牙髓受到龋源相关性细菌刺激或者直接外力损伤等破坏时,相关部位的这些成牙本质细胞可能死亡。然而这些损伤又能够刺激成熟牙髓组织中的一些前体细胞分化成为一种“成牙本质细胞样细胞”,这种细胞和成牙本质细胞的特性非常相似。成牙本质细胞样细胞的分化受到很多信号通路的调控,如TGF/smads、FGF、Wnt和Notch信号通路。在这些通路中,Notch信号通路被认为和细胞分化密切相关。Notch信号通路的下游分子Hey1,也可能参与成牙本质细胞样细胞的分化。Hey1(也被称为Hesr1、HRT1或HERP2)是属于HERP(hairy/Enhancer of split-related protein)家族的转录因子。HERP家族多为转录抑制物。Hey1被证明是Notch信号通路下游RBP-Jk的直接效应分子,其功能为细胞核效应器,并且在多种细胞分化过程中被证明是一个关键的转录因子。我们的前期研究发现Hey1在牙髓组织中有表达,然而Hey1在成牙本质细胞样细胞分化过程中的作用和机制却尚不清楚。在本课题的研究中,我们观察了Hey1在OLC细胞系(odontoblast-lineage cell line)受到两种分化诱导液——添加l-抗坏血酸(aa)、β-磷酸甘油(gp)和地塞米松(dex)的培养液以及添加rh-bmp2的培养液——刺激时的表达情况。之后将包含hey1编码全长的质粒和hey1shrna基因沉默的质粒分别转染入olc细胞系以构建hey1过表达及表达抑制的细胞系(分别命名为olc/hey1op和olc/hey1kd)。通过比较这些细胞系分化及矿化等能力之间的差异,探索hey1在成牙本质细胞样细胞分化过程中可能发挥的作用。本研究将有助于为hey1进一步应用于牙髓牙本质再生或活髓保存治疗提供新的思路。结果如下:1.hey1过表达对成牙本质细胞样细胞发生的影响将包含hey1编码全长的真核表达质粒pef-dest51-hey1转染至olc细胞系,rt-pcr及western-blot验证建立的olc/hey1op细胞系能够稳定过表达hey1。之后用以上两种分化诱导液刺激细胞。发现:olc/hey1op细胞中dspp、alp等矿化相关基因较正常olc细胞显著上调,western-blot及免疫荧光检测dsp蛋白表达量也上调。olc/hey1op细胞在诱导后的alp分泌活性高于olc细胞,茜素红s染色发现其矿化结节形成能力也较高。2.hey1基因抑制对成牙本质细胞样细胞发生的影响我们采用rna干扰的方法建立了hey1基因表达抑制的稳定细胞系olc/hey1kd,定量pcr验证表明olc/hey1kd中hey1表达显著降低。与hey1过表达相反,我们发现hey1的缺失会下调分别经过两种分化诱导液刺激后细胞矿化相关基因的mrna水平。olc/hey1kd细胞受刺激后的alp分泌活性及形成矿化结节的能力也低于正常olc细胞。3.notch信号抑制剂对hey1在成牙本质细胞样细胞发生中作用的影响为了进一步研究hey1调节成牙本质细胞样细胞分化的功能是否由notch信号通路激活的,我们应用dapt抑制notch信号通路以观察hey1以及olc细胞分化功能的改变。结果表明1μmol/ldapt能够有效抑制olc细胞中hey1的表达。与预先设想不同的是,在aa+gp+dex诱导液刺激时dapt会提高olc细胞的分化能力,而在用rh-bmp2诱导液刺激时,olc细胞的分化能力则受到dapt抑制,而过表达Hey1的细胞能够抵消这种抑制作用。这提示Hey1可能并不单是Notch信号通路的效应因子,也可能是不同信号通路之间互相作用的中间环节。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781

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本文编号：1146383