小鼠牙齿损伤修复中Notch信号表达及其与细胞凋亡相关研究

发布时间：2017-11-11 08:23

  本文关键词：小鼠牙齿损伤修复中Notch信号表达及其与细胞凋亡相关研究

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【摘要】：Notch信号通路通过相邻细胞间Notch受体和配体的结合传递信号,调控细胞的增殖、分化和凋亡,参与胚胎发育、器官形成和组织再生修复等过程。研究表明,Notch信号参与了牙齿发育过程,并在牙齿发育成熟后消失;但在牙髓损伤修复过程中,Notch信号被重新激活并主要表达于间充质细胞,在成牙本质细胞(Odontoblast,OB)中也有Notch信号的表达。牙髓损伤后牙髓间充质细胞中的Notch信号激活被认为是牙髓损伤修复过程中的早期分子事件,可能与促进牙髓损伤修复有关。OB细胞是牙髓组织中重要的功能细胞,是牙髓防御修复反应中形成第三期牙本质的执行细胞;OB细胞受到致龋菌毒力因素或损伤刺激后发生凋亡,诱导牙髓间充质细胞向损伤部位迁移并分化为新的OB细胞,后者分泌牙本质基质继而形成修复性牙本质是牙髓损伤修复的基本模式。小鼠切牙具有一生不断生长的特性,这使其成为研究牙齿损伤修复机制的良好模型。组织再生功能的维持依赖于干细胞的存在,而小鼠切牙牙根顶部的间充质干细胞和颈环上皮干细胞的存在保证了小鼠切牙的不断再生。研究发现,小鼠切牙颈环有Notch信号的表达。那么,小鼠切牙的再生过程中是否有Notch信号的参与?当小鼠切牙遭受机械损伤后,是否有Notch信号的激活表达和OB细胞凋亡变化?如果有,那么在损伤修复过程中Notch信号的激活与OB细胞凋亡是否存在联系?目前尚未见文献报道。因此,本课题通过建立小鼠切牙机械损伤的动物模型,研究在小鼠牙齿损伤修复中成釉器和牙髓组织Notch信号的表达以及OB细胞凋亡情况,并对OB细胞中的Notch信号和凋亡相关标志蛋白的表达情况进行了对比观察分析,旨在进一步了解Notch信号在牙齿损伤修复中的作用,以期为牙齿损伤修复提供新思路。主要的研究结果如下:1.机械损伤对成釉器细胞Notch信号表达的影响利用牙科高速手机和金刚砂车针磨除小鼠下颌切牙牙冠切1/2的牙体组织建立小鼠切牙机械损伤模型,并于损伤后3d、5d和7d取材,进而制备石蜡组织切片;采用免疫组织化学染色方法观察Notch1、Notch2在小鼠切牙成釉器细胞中的表达情况。结果发现:Notch1、Notch2在正常小鼠切牙的成釉细胞中不表达,在中间层和星网状层细胞中微弱表达,而机械损伤导致成釉器细胞Notch1、Notch2表达增强并呈现动态变化,表现为:在损伤后3d和5d,成釉细胞中出现了Notch1、Notch2的阳性表达,并且中间层和星网状层细胞中Notch1、Notch2的表达均增强,其中以Notch2的表达增强更明显;在损伤后7d,Notch1、Notch2的表达又逐渐减弱,表现为在成釉细胞中呈弱阳性表达或不表达,在中间层和星网状层细胞中呈弱阳性表达。以上结果提示Notch信号可能参与成釉器细胞的功能调控,Notch信号激活与切牙的损伤修复有关联。2.机械损伤对牙髓组织OB细胞Notch信号表达的影响利用牙科高速手机和和金刚砂车针磨除小鼠下颌切牙牙冠切1/2的牙体组织后,再用1/4#倒锥钻在其远中面颈部备洞至牙本质,建立小鼠切牙牙髓机械损伤模型,并于损伤后1d、3d、5d和7d取材,进而制备石蜡组织切片;采用免疫组织化学染色观察Notch1、Notch2在牙髓OB细胞中的表达情况。结果发现:Notch1、Notch2在正常小鼠切牙的牙髓OB细胞中微弱表达,而机械损伤可上调OB细胞中Notch1、Notch2的表达并呈现先上调后下降的动态变化,表现为:在损伤后1d,Notch1、Notch2呈阳性表达;在损伤后3d,Notch1、Notch2的表达进一步增强,呈强阳性表达;随后表达逐渐减弱,在损伤后5d呈阳性表达;在损伤后7d呈弱阳性表达。以上结果提示Notch信号可能参与OB细胞的功能调控,Notch信号激活与牙髓组织的损伤修复有关联。3.Notch信号激活与OB细胞凋亡的对比研究对第二部分实验中所制备的石蜡组织切片进行TUNEL染色观察OB细胞凋亡情况,结果发现:正常小鼠切牙的OB细胞层可见少量凋亡;在损伤后1d,近损伤区可见大量的凋亡细胞,OB细胞凋亡明显;在损伤后3d,近损伤区的凋亡细胞明显减少,仅见少量OB细胞凋亡;在损伤后5d和7d,OB细胞层均仅见少量凋亡。对比实验二的结果我们发现,牙髓损伤后OB细胞凋亡数量变化趋势与Notch信号激活的动态变化趋势相似,但二者的峰值时间不同,前者在损伤后1d,后者则在损伤后3d。因此我们推测,牙髓损伤后Notch信号激活可能与细胞凋亡调控存在一定联系。为此,随后我们进一步用免疫组织化学染色对OB细胞中Notch1、Notch2和抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白cleaved-Caspase-3的表达情况进行了对比观察,结果发现:在对照组,Notch1、Notch2均有微弱表达,Bcl-2不表达,cleaved-Caspase-3在少量细胞中呈弱阳性表达;在损伤后1d和3d,OB细胞Notch1、Notch2均呈明显的阳性表达;Bcl-2在损伤后1d不表达,在损伤后3d呈弱阳性表达;cleaved-Caspase-3在对照组少量细胞中呈弱阳性表达,在损伤后1d其弱阳性表达的细胞数量有所增加,但在损伤后3d又明显减少。对比Notch1、2和Bcl-2、cleaved-Caspase-3的表达变化情况,我们推测牙髓损伤后OB细胞中Notch信号和Bcl-2的激活可能参与细胞凋亡调控。通过以上实验我们得出以下结论:1.机械损伤导致成釉器细胞的Notch信号被激活并呈动态变化,提示Notch信号可能参与小鼠切牙成釉器细胞的功能调控,从而参与调控切牙的损伤修复。2.Notch信号在正常小鼠切牙OB细胞中微弱表达,机械损伤后OB细胞出现先上调后下降的动态变化,提示Notch信号可能参与OB细胞的功能调控,从而参与牙齿的损伤修复过程。3.机械损伤可诱导OB细胞凋亡,且细胞凋亡的数量变化趋势与Notch信号激活的动态变化趋势相似,提示Notch信号激活可能与细胞凋亡调控存在一定联系;据进一步研究结果推测,Notch信号可能与抗凋亡蛋白Bcl-2相关联,参与牙髓损伤后的OB细胞凋亡调控,但尚需进一步研究证实。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R780.2

【参考文献】

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1 梁振兴;杨阳;李悦;金振晓;王宁;易定华;段维勋;陈文生;;γ-分泌酶抑制剂对人脐静脉内皮细胞系增殖凋亡的影响[J];临床医学工程;2012年06期

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本文编号：1170583