纤维连接蛋白修饰的种植体3D微沟槽形貌颈圈对人牙龈成纤维细胞生物活性影响的研究

发布时间：2017-11-14 11:25

  本文关键词：纤维连接蛋白修饰的种植体3D微沟槽形貌颈圈对人牙龈成纤维细胞生物活性影响的研究

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【摘要】：目前在颌骨中植入钛种植体已成为修复牙缺失及骨折的常规方法。种植体作为牙列缺失后天然牙的替代物,其植入后与颌骨形成种植体-骨界面,与牙周组织种植体-软组织界面。人的口腔环境复杂,种植体若要长期存在并具有功能,首先要有坚固的骨性结合存在于种植体与牙槽骨之间,再者需要良好的软组织封闭位于种植体颈部起到屏障作用,两者同等重要。种植体表面黏附了牙龈结合上皮及牙龈纤维后组成这层屏障。由牙龈成纤维细胞及其分泌合成的胶原纤维构成的种植体周围结缔组织附着于种植体表面,是种植体穿龈部分软组织愈合的重要组成部分,这部分结构如果愈合良好,能为表层上皮提供坚实的基底组织,防止上皮根方迁移,加强边缘封闭,减少细菌入侵,减少了因种植体周围软组织炎症引起的牙龈退缩而导致前牙美观问题,同时也保护了深层骨组织愈合。研究表明种植体颈部表面的化学成分以及性质,种植体材料的生物相容性及形状结构均可对细胞附着产生影响,其中种植体颈部表面的几何结构研究已经变成目前的热点。种植体颈圈的微米级沟槽形貌设计,该结构设计使种植体穿龈部分具有良好的亲水性和生物相容性,增加了种植体穿龈部分的表面积,提供更多黏附蛋白如纤维连接蛋白(FN)的黏附位点,有利于促进牙龈成纤维细胞分泌更多的内源性FN,也可吸附和激活更多血小板,共同促进后续更多牙龈成纤维细胞黏附聚集。经研究证实,在众多沟槽尺寸中亲水性及生物相容性最佳的沟槽尺寸为T60/10(60微米宽10微米深)沟槽形貌。但T60/10仍有不足,其对血浆纤维连接蛋白(FN)的黏附能力有限,而FN作为一种细胞外基质大分子量的蛋白,具有多种功能,其可以增加成纤维细胞附着数量,促进创面愈合。由于T60/10对促进牙龈成纤维细胞早期的黏附并未达到最佳,而种植体植入早期是种植体颈部如未及时地形成良好的软组织封闭,易导致感染的发生,因此改进T60/10的不足,在植入早期促进其在种植体颈部形成良好的软组织封闭至关重要。目的:本课题以进一步提高T60/10沟槽颈圈早期软组织愈合为出发点,对微米级的沟槽钛表面进行血浆纤维连结蛋白(FN)的修饰,弥补T60/10沟槽对血浆FN吸附能力较弱的不足,明显提高材料表面对血浆FN的吸附率。通过体外实验评价修饰FN后的T60/10沟槽对牙龈成纤维细胞在增殖、黏附及分泌合成功能等生物学行为的影响,为进一步研究改良后的材料与软组织早期附着的关系提供基础,同时为今后新材料的开发提供实验依据。方法:采用硅烷化的方法对微米级的沟槽钛表面进行血浆FN的修饰。通过X线衍射能谱分析、FN蛋白免疫荧光技术、ELISA检测修饰于材料表面的FN蛋白含量及分布。同期通过场发射扫描电镜、原子力显微镜及接触角检测仪对修饰FN的材料进行表面形貌、粗糙度及表面亲水性的检测。分别在修饰FN的T60/10沟槽钛表面及光滑钛表面接种人牙龈成纤维细胞并进行培养,通过CCK8检测细胞的增殖情况;场发射扫描电镜、细胞免疫荧光技术检测细胞的附着情况;考马斯亮蓝染色技术、I型胶原纤维ELISA实验及Real-time PCR技术检测修饰了FN后的材料表面对HGF分泌功能的影响。结果:(1)采用硅烷化的方法对微米级的沟槽钛表面进行血浆FN的修饰后,XPS测得的材料表面元素组成表及ELISA检测的OD值均表明FN含量明显多于直接浸泡组,且有统计学意义(P0.05)。通过荧光显微镜观察荧光染色的FN蛋白,发现其在材料分布均匀,荧光像素明显高于对照组,同样有统计学意义(P0.05)。(2)场发射扫描电镜观测结果显示硅烷化后T60/10的表面并未被硅烷化反应过程中的化学试剂腐蚀,沟槽尺寸不变。原子力显微镜检测发现修饰FN后的材料粗糙度增加,相对于空白组有统计学意义(P0.05)。接触角检测仪修饰FN的材料表面润湿角小于未修饰材料,同样有统计学意义(P0.05)。(3)细胞的增殖及黏附情况:DAPI染色检测HGF接种在硅烷化修饰FN的沟槽组和光滑组、空白沟槽组和光滑组钛金属表面2h、4h、6h后早期附着的细胞数。HGF接种2h时,四组材料表面所观察到的蓝色荧光亮点数量较少,数量基本相同。从4h开始四组材料上黏附的细胞明显增多,且硅烷化的两组材料上黏附的细胞数均大于空白组,其中硅烷化沟槽组的细胞数最多,硅烷化光滑组的细胞数大于空白光滑组,而硅烷化光滑组与空白沟槽组细胞数相当,空白沟槽组表面细胞数多于空白光滑组。6h时,四组材料上的细胞数增加更加明显,硅烷化沟槽组材料表面的细胞数增加最为明显,细胞数远远多于其他三组材料。硅烷化的光滑组也较多于空白沟槽组,上述三个时间段的DAPI染色实验说明通过硅烷化修饰了FN的材料能有效促进HGF对其表面的早期附着。CCK8法检测HGF接种在硅烷化沟槽组和光滑组、空白沟槽组和光滑组钛金属表面6h、12h、1d、3d、5d、7d后细胞增殖数量,发现4组材料上的细胞数量随时间延长而增加,其中在6个时间段,硅烷化沟槽组材料表面的细胞数量均大于其他三组材料,且都有统计学意义(P0.05);硅烷化光滑组表面的细胞数量除了1d大于空白沟槽组外(P0.05)其他时间段均低于未修饰沟槽组(P0.05),而空白光滑组表面的细胞数在每个时间段均少于其他三组(P0.05)。荧光显微镜观察HGF在4组不同材料上1d、3d、5d的数量及形态学变化,细胞数量方面观察结果与CCK8的结果基本一致。硅烷化沟槽组与空白沟槽组一样,细胞沿着沟槽呈长条形,排列规则。硅烷化的光滑组与空白光滑组一样,细胞排列不规则,细胞呈多边形。硅烷化的两组材料细胞伸展范围较大,细胞伪足较长。(4)通过1、3、5d考马斯亮蓝染色及5d的I型胶原纤维ELISA实验发现,硅烷化的两组材料上的细胞外的总蛋白含量及细胞外I性胶原纤维的数量均高于空白组材料。经过Real-time PCR分析,硅烷化的两组材料上的HGF的I型胶原纤维m RNA表达水平较空白组高,以上差异均有统计学意义(P0.05)。结论:采用硅烷化的方法将血浆纤维连接蛋白(FN)修饰在T60/10表面不仅不会改变其表面原有的沟槽形态,还可以增加材料的亲水性,弥补其对血浆纤维连结蛋白吸附能力较弱的不足,修饰FN的材料表面相对空白组均有较好的生物相容性,能有效促进人牙龈成纤维细胞的增殖、黏附。同时修饰FN的材料表面合成蛋白质及I型胶原纤维的数量较空白组多,在硅烷化材料上的HGF其I型纤维m RNA表达水平较空白组高,由于HGF与其分泌的I型胶原纤维是种植体颈部“颈圈”的重要组成部分,所以修饰FN的材料将在种植体颈部软组织愈合,预防感染方面有积极的作用。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.6

【参考文献】

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本文编号：1185201