PEN载体传递ODN对人成骨样细胞细胞周期与成骨分化的影响

发布时间：2017-11-15 04:23

  本文关键词：PEN载体传递ODN对人成骨样细胞细胞周期与成骨分化的影响

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【摘要】：寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)是一种单链寡核苷酸,易于与它们的互补链相对接,在数量上通常含有50个以下的碱基,在自然界中常存在于DNA或RNA的降解产物中。MT01包含有27个碱基,是依据人线粒体DNA设计的特定序列的ODN,目前已被证实,MT01可以通过Toll样受体9(Toll like receptor 9,TLR9)和Toll样受体7(Toll like receptor 7,TLR7)促进成骨细胞的成骨分化,抑制破骨细胞的成熟,阻止大鼠牙周炎模型中牙槽骨的破坏性吸收,对牙槽骨骨重塑具有影响作用。MT01被细胞摄取的主要方式为胞吞作用,然而由于MT01表面带有负电荷,易与细胞表面的负电荷产生静电排斥反应,不易被细胞摄取。同时,MT01在体内并不稳定,易被核酸酶降解,因而其细胞的摄取效率较低。目的:为提高MT01的摄取效率,本实验拟采用新型载体N-异丙基丙烯酰胺修饰的聚乙烯亚胺(N-Isopropylacrylamide-Modified Polyethylenimines,PEN)对MT01进行传递。通过检测人成骨样细胞(MG63)的细胞周期及成骨相关因子的表达,探讨PEN是否能成为MT01的高效载体对MG63的成骨分化产生影响。方法:本实验将对MT01和PEN分别以1:2、1:4、1:6三种不同的装载比例进行静电装载,形成MT01/PEN复合物后对MG63细胞进行转染。分别设置PEN、MT01及S-MT01三组作为对照组,三种比例的MT01/PEN复合物作为实验组。选取四种指标进行测定,评估MT01/PEN复合物对MG63增殖分化的影响。实验一对转染后的MG63进行染色,选用流式细胞仪检测MG63细胞周期的变化,实验二检测成骨分化相关蛋白ALP的活性,实验三使用ELISA法检测BMP2蛋白表达情况,实验四使用ELISA法检测OCN蛋白表达情况。结果:MG63细胞周期检测结果:与阴性对照组及MT01组相比,MT01/PEN复合物组MG63处于Gl、G2期细胞比例减少,处于S期细胞比例增加(P0.01)。与S-MT01组相比,MT01/PEN复合物组MG63处于G2期细胞比例均减少,处于S期细胞比例增加(P0.01),G1期细胞比例增加(P0.01)。ALP活性检测结果:与阴性对照组及MT01组相比ALP活性明显增高(p0.01),同S-MT01组相比,1:4及1:6比例的MT01/PEN复合物在24h、72h时导致MG63中ALP活性升高(p0.01),而在48h时,三种比例MT01/PEN复合物均可引发MG63内ALP活性升高(p0.01)。BMP2检测结果:与阴性组相比,其余各组BMP2表达均有增加;与MT01、S-MT01组相比,PEN/MT01复合物在24h BMP2表达上升;在72h,与MT01组及S-MT01组比较,比例为1:2与1:6的PEN/MT01复合物BMP2表达升高。OCN检测结果:除72h MT01组,余各组与同时间点阴性组相比,OCN表达增加;24h和48h,1:6比例MT01/PEN组OCN表达高于MT01组(p0.05);不同比例MT01/PEN组复合物与S-MT01组相比,OCN表达无统计学差异与MT01组以及S-MT01组相比。结论:PEN可以做为一种高效载体,提高MT01的转染效率。不同装配比例的MT01/PEN复合物均可对成骨样细胞的增殖分化有影响,其中装配比例在1:6时其影响最为明显。MT01/PEN复合物可以通过影响MG63的细胞周期,缩短细胞进入S期的时间促进其增殖,且其促进效果明显优于MT01、S-MT01。MT01/PEN复合物可以增加成骨相关因子如ALP、OCN、BMP2的表达。且其促进效果明显优于MT01、S-MT01。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R783.5

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