周期性张应力对人牙周膜细胞Periostin与Ⅰ型胶原表达的影响

发布时间：2017-11-20 06:12

  本文关键词：周期性张应力对人牙周膜细胞Periostin与Ⅰ型胶原表达的影响

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【摘要】：研究背景和目的：口腔正畸过程中,力学因素对牙周组织改建的影响贯穿了治疗整个过程。人牙周膜细胞(hPDLCs)是人牙周组织的主要成分,是矫治力的直接效应细胞,不仅合成了人牙周膜细胞外基质中大多数的各型胶原纤维和蛋白多糖,而且还通过分泌和合成多种细胞因子与酶触发多条胞外及胞内信号传导网络,共同参与调节牙周组织的代谢和改建。而hPDLCs如何将力学刺激信号转化为细胞内生化学信号,最终引起基因表达变化,而这一过程是如何进行的,其中涉及哪些信号通路有哪些相关基因表达,其确切机制一直是国内外学者探索的前沿课题。以往研究表明许多细胞因子,激素和神经肽等物质通过局部或全身途径影响牙周细胞来促进正畸牙的牙周组织改建。如何应用细胞因子控制正畸牙移动,以达到缩短矫治疗程,是当前口腔正畸学基础研究的热点之一。Periostin(PN)属成束蛋白(fasciclin)家族成员,分子量为90kD,主要由氨基末端(EMI域)、4个重复成束蛋白结构域(fasl域)和羧基末端(C末端)构成,在牙周膜和骨膜特异性表达。PN是一种力学敏感因子,在机械应激导致的组织修复和再生,以及维护牙周组织的完整性、牙齿的发育以及萌出发挥着重要的作用。这提示PN可能在人正畸牙周组织改建扮演重要的角色,而目前PN仅仅限于啮齿动物牙齿发育及萌出方面的体内外试验性研究而在正畸领域研究较少,从体外细胞基因和蛋白水平研究应力下人牙周膜细胞PN的表达尚未见报道。因为PN与Ⅰ型胶原存在共同的分布区域,且可直接与Ⅰ型胶原结合,有研究发现PN基因剔除的小鼠胶原纤维的直径减小,胶原交联水平降低,这就提示了PN可调节Ⅰ型胶原纤维的合成,成为纤维结缔组织的生物力学特性的重要介质。Ⅰ型胶原作为人正畸牙牙周组织改建的最终产物之一,而PN可调节纤维形成和胶原蛋白的交联,因此,两者有可能通过某种信号通路或多种信号通路交叉联系。本实验采用Flexcell-5000 Tension System应力加载系统对体外培养的hPDLCs加载机械力,构建细胞力学刺激模型,模拟正畸牙齿移动过程中的施力方式,从细胞基因水平和蛋白水平研究PN与Ⅰ型胶原在hPDLCs中的表达的情况,初步探讨PN与Ⅰ型胶原在周期性张应力引起的hPDLCs细胞力学信号转导过程中的作用,有助于了解PN与Ⅰ型胶原之间的信号传导通路,为进一步阐明牙周组织在正畸矫治力作用下的适应性改建机理及机械力信号在细胞内转导的分子机制提供理论依据。本论文主要包括以下两部分内容：第一部分hPDLCs体外培养-力学刺激模型的构建目的：体外分离培养hPDLCs,通过观察细胞形态特征,检测其生长曲线,矿化能力并进行免疫组化鉴定。细胞加力后观察细胞生长形态、排列及增殖情况,确定是否成功构建力学刺激模型。方法：1.分离培养hPDLCs收集临床新鲜拔除的牙周健康、无龋的智齿或正畸拔除牙,刮下根中1/3牙周膜组织,采用改良型组织化酶消化法培养。2. 倒置显微镜下观察细胞形态特征：利用MTT法检测hPDLCs的生长增殖情况,绘制生长曲线；对细胞矿化诱导21d后,观察矿化结节形成情况；通过免疫细胞化学方法检测培养细胞的波形丝蛋白和角蛋白的表达,对hPDLCs来源进行初步鉴定。3.将第4-6代hPDLCs随机分为4个实验组和1个对照组。实验组分为施加周期性张应力6h、12h、24h、48h,以加力0h为对照组。4.周期性张应力加载采用Flexcell FX-5000 Tension System应力加载系统,具体设置为：正弦波,形变10%,频率0.5 Hz。加力后利用倒置显微镜观察细胞形态、排列的情况。5.四唑盐(MTT)比色试验：在细胞加力6h、12h、24h、48h后,每孔加入5g/L的MTT 200ml,继续培养4h,吸弃上清液,当各组反应完成后,每孔加入3m1二甲基亚砜(DMSO),充分振荡10min,使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪测定各孔细胞490nm波长的光吸收值(OD值)。结果：1. 改良型组织块酶消化法分离培养hPDLCs,游出率和成活率较高。形态学观察显示：游出细胞多为梭形或星形。传代细胞在24h后贴壁,贴壁后hPDLCs逐渐伸展为不规则圆形、多角形、梭形,呈放射状或漩涡状生长。2.细胞呈对数生长趋势,曲线成倒S型,符合细胞生长规律；矿化诱导染色,镜下可见散在红色矿化结节,具成骨能力；免疫细胞染色显示波形丝蛋白染色细胞胞浆可见黄色颗粒,角蛋白染色细胞胞浆未见黄色颗粒；以上表明细胞取材于牙周膜组织,属于中胚层来源细胞,且无上皮细胞的污染,证实是hPDLCs,可用于进一步的研究。3.加力后细胞形态排列的情况：细胞基本无脱落,生长状态良好；实验组细胞呈长梭形；细胞排列更加有序,由漩涡状排列逐渐向栅栏状平行生长,与加载牵张力的方向相一致。4.检测加力后细胞增殖活性的MTT结果表明：与对照组比较,加力6h时细胞增殖活性降低,加力12h开始增强,加力24h增殖活性继续增强达到本次实验的峰值,而加力48h细胞增殖活明显降低。5. hPDLCs体外培养-力学刺激模型成功构建。第二部分 周期性张应力对人牙周膜细胞Periostin与Ⅰ型胶原表达的影响目的：旨在了解体外培养的hPDLCs加载周期性张应力后hPDLCs Periostin与Ⅰ型胶原表达的影响,初步探讨PN与Ⅰ型胶原在应力下hPDLCs细胞力学信号转导过程中的作用。方法：1.本实验将第4-6代hPDLCs随机分为4个实验组和1个对照组。实验组分为施加周期性张应力6h、12h、24h、48h,以加力0h即不加力为对照组。对实验组加载形变10%,频率0.5 Hz的周期性张应力。2. qRT-PCR:使用Trizol提取牙周膜细胞的总RNA,逆转录成cDNA后,采用SYBR green法进行荧光定量实时PCR扩增,通过相对定量法计算2-△△Ct值,检测PN与Ⅰ型胶原mRNA相对表达情况。3. Western blot:蛋白裂解液获取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度, SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育、显影及定影,检测人牙周膜细胞PN蛋白的表达。用Quanlity one图像分析系统软件进行灰度值分析。4. 重复三次实验所得结果应用SPSS13.0软件进行统计分析,对所测得的结果进行正态性及方差齐性检验。多组间比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间比较则用LSD检验,方差不齐选用Dunnett's T3检验。检验水准为a=0.05,P0.05认为有显著差异。结果：1. qRT-PCR结果显示：PN mRNA的表达：在正常hPDLCs内表达PN mRNA,加载张应力6h后,PN mRNA表达降低(P0.05),而在加力12h后,表达开始增强,此后持续增强至加力24h达最高峰(P0.05),48h后开始下降恢复至不加力时的表达水平(P0.05)；Ⅰ型胶原mRNA的表达：与对照组相比,加载张应力6h,12h后,Ⅰ型胶原mRNA表达无明显改变,加力24h,表达开始增强,此后持续增强至加力48h达最高峰(P0.05)。2.经Westernblot检测：细胞加载张应力6h时,PN蛋白表达明显降低(P0.01),加力12h后PN蛋白表达开始逐渐升高,并持续到加力24h时,PN蛋白表达显著增强,达到最高水平(P0.01)；而在加力48h时,PN蛋白表达开始下降,恢复至不加力时的表达水平(P0.05)。全文结论：1.改良型组织块酶消化法能成功培养出hPDLCs,并成功构建hPDLCs体外培养-力学刺激模型。2.在一定时间内的周期性张应力(形变率为10%,频率为0.5Hz,波形为正弦波)加载可促进hPDLCs PN与Ⅰ型胶原表达,Ⅰ型胶原表达增强明显晚于PN表达基因,两者表达具有时序性,推测Ⅰ型胶原位于PN的下游发挥作用。3.周期性张应力作用下,PN与Ⅰ型胶原参与了细胞机械应力信号转导过程。4.PN与Ⅰ型胶原可能作为主要的调控因子参与正畸牙周组织的改建。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.5

【参考文献】

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1 ;Sputum interleukin-17 is increased and associated with airway neutrophilia in patients with severe asthma[J];Chinese Medical Journal;2005年11期

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本文编号：1206349