SATB2-Nanog通路调节人牙槽骨间充质干细胞衰老及相关机制研究

发布时间：2017-12-05 07:01

  本文关键词：SATB2-Nanog通路调节人牙槽骨间充质干细胞衰老及相关机制研究

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【摘要】：增龄性的骨量丢失与骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的衰老密切相关,来源于神经嵴的牙槽骨拥有明显的位点和衰老相关特性。然而牙槽骨来源的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells from alveolar bone, AB-BMSCs)的特性和其潜在调节机制仍然不完全清楚。本课题在比较分析不同年龄牙槽骨来源BMSCs体外生物学特点的基础上,探讨核基质蛋白特异AT序列结合蛋白2(special AT-rich binding protein 2, S ATB2)在调控AB-BMSCs增龄性特性变化中的作用及相关机制。第一部分：人牙槽骨间充质干细胞生物学特征的增龄性变化目的：体外分离培养不同年龄组的AB-BMSCs,分析不同年龄组AB-BMSCs生物学特性及SATB2表达水平变化。方法：1)利用全骨髓贴壁法体外提取并培养人AB-BMSCs,待细胞从组织块中爬出,换液去除未贴壁细胞及组织块,当形成单克隆集落并且当各集落相互接触时进行传代培养；2)通过实时定量PCR、Western bolt和细胞免疫荧光检测不同年龄组AB-BMSCs的SATB2表达差异；3)采用结晶紫染液染色培养8d不同年龄组AB-BMSCs,分析其克隆形成能力；4)通过CCK8法分析其增殖能力；5)通过Western bolt和细胞免疫荧光检测不同年龄组AB-BMSCs的干性因子表达；6)通过矿化诱导、成脂诱导液培养BMSCs并进行实时定量PCR、 Western bolt、茜素红钙结节染色和油红O染色检测BMSCs的多向分化能力；7)通过β-Gal染色、Western bolt分析不同年龄组AB-BMSCs衰老相关因子表达。结果：(1)随着年龄增大AB-BMSCs中SATB2的表达量下降。(2)年轻组(young group, Y)的AB-BMSCs克隆集落明显多于中年组(middle group, M)和老龄组(old group, O)细胞,随着年龄的增加克隆形成能力下降；CCK8实验结果显示从细胞培养第三天开始同一时间点的年轻组AB-BMSCs吸光度值大于中年组大于老龄组细胞；随着年龄的增大,AB-BMSCs中Nanog、性别决定区Y框蛋白2(SRY(sex determining region Y)-box 2, SOX2).八聚体转录因子4 (octamer-binding transcription factor-4,OCT4)蛋白表达水平下降。(3)AB-BMSCs中runt-相关转录因子2(runt-related transcription factor 2, RUNX2)、OSX、骨桥素(osteopontin, OPN)等成骨相关蛋白表达水平老龄组明显低于年轻组和中年组,并且钙结节形成能力下降；随着年龄的增加老龄组AB-BMSCs中成脂相关因子Leptin、过氧化物酶体增生物激活受体Y(peroxisomeproliferator-activated receptor gamma, PPAR-γ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha, C/EBP-α) mRNA高表达,油红O染色形成脂滴老龄组多于中年组多于年轻组；老龄组核因子-κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB, RANK)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulation factor, MCSF)等破骨因子mRNA高表达,而骨保护素(osteoprotegerin, OPG)表达明显下降,核因子-κ,B受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL) mRNA表达中年组大于年轻组而老龄组表达水平最低。(4)随着年龄增加衰老染色阳性细胞比例增加,抗氧化应激性能力下降,P16、P21、P53等衰老相关蛋白表达水平增多。结论：随着增龄性的变化,AB-BMSCs中SATB2表达水平下降；干性、成骨分化能力减弱；而成脂分化、细胞衰老及破骨激活能力增强。第二部分：SATB2表达水平对牙槽骨间充质干细胞干性及衰老的影响目的：分析过表达和敲减SATB2对AB-BMSCs的增殖能力、干性、衰老的影响和诱导成骨、成脂分化能力的调控。方法：1)SATB2过表达病毒载体转染老年组AB-BMSCs, SATB2敲减病毒载体转染年轻组AB-BMSCs,通过CCK8实验检测SATB2过表达BMSCs、转染了GFP对照组及SATB2敲减的BMSCs和转染了GFP对照组BMSCs的增殖能力；2)Western bolt实验分析Nanog、SOX2、OCT4等干细胞多潜能因子及衰老相关蛋白P16、P21、P53的表达；3)通过β-Gal染色分析不同处理组AB-BMSCs衰老表现；4)茜素红钙结节染色和CPC实验分析不同处理组细胞诱导成骨分化能力；5)Western bolt测定RUNX2、OSX、OPN成骨相关因子蛋白表达；6)实时定量PCR检测Leptin、PPAR-γ、C/EBP-α成脂相关因子的mRNA表达。结果：(1)老年BMSCs过表达SATB2后,细胞增殖能力无明显改变,干性指标表达升高,衰老染色阳性细胞数减少,P16、P21、P53衰老相关蛋白表达降低；诱导成骨能力增强,RUNX2、OSX、OPN成骨相关因子蛋白表达增加；Leptin、PPAR-γ、 C/EBP-α成脂相关因子的mRNA表达下降。(2)与上述结果相反,年轻组BMSCs敲减SATB2后,细胞增殖能力下降,干性指标表达下降,衰老染色阳性细胞数增多,P16、P21、P53衰老相关蛋白表达增加；诱导成骨能力下降,RUNX2、OSX、OPN成骨相关因子蛋白表达下降; Leptin、 PPAR-γ、C/EBP-α成脂相关因子的mRNA表达升高。结论：核基质蛋白SATB2是AB-BMSCs增龄性特征变化的关键性调节因子。第三部分：SATB2-Nanog通路调控牙槽骨间充质干细胞衰老的机制研究目的：分析SATB2-Nanog通路调控AB-BMSCs多潜能因子表达、衰老相关特性和成骨能力的影响,探讨该通路参与AB-BMSCs衰老的相关机制。方法；1)SATB2过表达病毒载体稳定转染老年BMSCs后,小干扰RNA敲减Nanog,通过Western bolt实验和实时定量PCR检测Nanog、SOX2、OCT4等干细胞多潜能因子蛋白及mRNA表达；细胞免疫荧光检测AB-BMSCs的Nanog表达差异；通过β-Gal染色分析衰老染色阳性细胞数；Western bolt实验测定P16、P21、P53衰老相关蛋白表达；茜素红钙结节染色和Western bolt实验分析诱导成骨能力的变化。2)CHIP实验分析SATB2与Nanog DNA序列启动子区的结合位点；3).双荧光素报告酶基因实验检测验证SATB2与Nanog分子间可能存在的结合与调控关系。结果：(1)SATB2过表达病毒载体稳定转染老年BMSCs小干扰RNA敲减Nanog后,Nanog、SOX2、OCT4等干细胞多潜能因子蛋白及mRNA表达下降；β-Gal染色分析衰老染色阳性细胞数增多；P16、P21、P53衰老相关蛋白表达增多；诱导成骨能力下降。(2)CHIP结果显示SATB2与Nanog启动子区四个位点发生结合。(3)双荧光素报告酶基因实验证实四个阳性结合位点中SATB2与Nanog启动子区第10号片段发生结合并参与调控基因表达。结论：SATB2调控AB-BMSCs增龄性特征是通过Nanog发挥作用,SATB2-Nanog轴调控AB-BMSCs的衰老及多潜能分化过程。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782

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本文编号：1253942