一个遗传性牙本质发育不良Ⅰ型家系致病基因鉴定及其分子机制研究

发布时间：2017-12-06 12:29

  本文关键词：一个遗传性牙本质发育不良Ⅰ型家系致病基因鉴定及其分子机制研究

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【摘要】：背景与目的牙齿的缺陷是人类疾病的一个重要部分,牙齿发育是生物整体发育中一个很重要的事件。根据目前的研究进展,遗传性牙本质缺陷分为5种类型：遗传性牙本质发育不全分为3种类型,遗传性牙本质发育不良分2种类型。遗传性牙本质发育不全Ⅰ型是成骨发育不全症伴随牙本质发育不全。遗传性牙本质发育不良Ⅱ型,遗传性牙本质发育不全Ⅱ型以及遗传性牙本质发育不全Ⅲ型的致病基因为编码主要的非胶原蛋白基因DSPP且遗传缺陷方式仅限于牙齿。遗传性牙本质发育不良(dentin dysplasia)是一种常染色体显性遗传病,分为Ⅰ,Ⅱ两个亚型,Ⅰ型牙本质发育不良的发病率为十万分之一,属于罕见病,而且致病基因并没有被发现[1]。遗传性牙本质发育不良Ⅰ型主要临床表现为牙髓腔闭塞,牙根短小,我们通过一个包含有14个病人的中国大家系的连锁分析将DDI致病基因定位在3p26.2-3p24.3,经过进一步的筛查和测序,在3p26.1确定致病基因ssuh2的一个错义突变c.353CA(P118Q),此突变在遗传性牙本质发育不良Ⅰ型家系中出现遗传共分离。紧接着我们对ssuh2在家系成员体内的mRNA表达水平进行了研究,同时对体外细胞的mRNA和蛋白表达水平进行研究及蛋白质的亚细胞定位。本课题组发现的遗传性牙本质发育不良Ⅰ型(DD-I)致病基因ssuh2在牙齿发育中的作用与功能还需要更进一步的探索。由于斑马鱼和小鼠的牙齿都有牙髓腔、牙本质和类牙釉质,在牙齿附着期间存在釉器,也有类似于人类牙齿的发育期,即蕾状期、帽状期、钟状期,只是相对简单且周期很短,和人类以及其它哺乳动物的牙齿有很多相似点,而且斑马鱼与小鼠还具有繁殖周期短,实验数量大等优点,因此,斑马鱼和小鼠能够作为牙齿发育研究的模式生物。斑马鱼中调控牙齿发育的基因有BMPs、FGF、Alk8、Pitx2a、Dlx、Pax9,它们在人类中都有相应的同源基因。在本课题组的前期研究中,我们确定了ssuh2基因在斑马鱼中的同源基因zgc：153440在斑马鱼中的表达及功能。因此,我们通过吗啉修饰的反义寡核苷酸(MO)降低ssuh2基因在斑马鱼中的同源基因表达的方法来研究它在牙齿发育中对其它基因的影响,实现在斑马鱼中研究牙齿发育相关基因的完整路线,同时确定人类ssuh2基因与牙齿发育的相关性。由于基因敲除技术抑制基因的表达,降低甚至是消除某个基因在小鼠体内的表达,然后从形态、组织以及分子等水平来研究它对生物的影响,可以了解它的功能。我们对ssuh2基因在小鼠中的同源基因进行了时空表达分析以及该基因在小鼠各个器官的表达水平分析。随后,我们通过kncok-in技术构建了基因缺陷小鼠,通过普通PCR扩增技术和Sanger测序技术进行基因缺陷小鼠的基因型鉴定。根据ssuh2基因在小鼠中的同源基因的表达谱,我们选取不同基因型(野生型,杂合突变,纯合突变)出生后15天(P15)小鼠的下颌组织进行表达量的分析以及出生后三个月(d90)小鼠下颌组织形态的分析。因此,本课题以斑马鱼和基因缺陷小鼠作为动物模型,采用“敲低表达”的方法实现模式动物的构建,通过相应的实验手段,初步研究了ssuh2基因在斑马鱼牙齿发育过程中对其他基因的影响以及ssuh2基因缺陷小鼠的表型鉴定。材料与方法1.家系标本采集和临床资料采集：采取大家系中每个成员的外周血,提取DNA和RNA；收集患者的临床病历资料。2.连锁分析：利用基于SNP的连锁分析确定致病基因所在区域,并通过微卫星定位进行验证。3.目标区域捕获测序筛查SNP位点,对于筛查到的SNP进行验证及家系共分离实验,最后确定致病基因ssuh2。4.使用高分辨率熔炼曲线(High Resolution Melting, HRM)技术筛查当地人群1000份随机样本,确定ssuh2基因c.353CA(P118Q)的突变频率。5.ssuh2的生物信息分析：通过SOSUI对ssuh2进行蛋白二级结构预测；用I-TASSER预测ssuh2的三位蛋白结构；通过PolyPhen2预测突变P118Q的功能改变。6.通过提取家系成员的外周血RNA,对基因ssuh2进行体内mRNA表达水平分析7. ssuh2蛋白的亚细胞定位：将人类ssuh2基因正常转录本与异常转录本的cDNA克隆到载体pEGFP-C1上利用lipo2000转染试剂按说明转染到已培养好的COS7细胞中,转染后24小时用DAPI染核技术染核,于荧光显微镜下观察拍照,比较野生型蛋白与突变型蛋白在细胞中表达部位的差异。。8.在体外对ssuh2进行mRNA表达水平和蛋白表达水平研究。9.利用NCBI的BLAST在线比对软件,搜寻人类Bmp2a,Pitx2,Pax9在斑马鱼中的同源基因,对它们的相似性进行分析。通过Primer3软件对斑马鱼中的同源基因设计引物,用于扩增相应基因的mRNA的CDS区。10. 将牙齿发育相关基因的CDS区克隆到载体pBSK上,然后用T7体外转录试剂盒合成该同源基因的反义RNA探针。11. 通过显微注射将morpholino导入斑马鱼的受精卵,使用整体原位杂交技术分析斑马鱼相关基因在ssuh2基因表达降低时的影响。12.通过NCBI软件找出ssuh2基因在小鼠中的同源基因,并用Primer3在线软件设计引物,在RNA水平构建小鼠ssuh2同源基因的表达谱。13.取正常C57BL/6小鼠不同器官包括心,肝,脾,肺,肾,脑,下颌,小肠等组织,利用液氮研磨,TRIZOL提取组织RNA,然后用逆转录试剂盒转录为cDNA作为模版进行PCR,观察ssuh2基因在小鼠不同器官中的表达。14.取不同时期正常C57BL/6小鼠的下颌,包括E1,E3,E5,E7,E11,P3,P7,P15利用液氮研磨,TRIZOL提取组织RNA,构建ssuh2基因在小鼠中的时空表达谱。15.通过knock-in技术产生基因缺陷小鼠,经过交配产生不同基因型(正常,杂合,纯合)小鼠。16.对小鼠进行剪脚趾编号并用碱裂解法对剪下的脚趾提取DNA, PCR后产物用Sanger测序确定小鼠基因型。17.取三个月大不同基因型小鼠的下颌,经过固定,脱水,包埋等步骤后进行石蜡切片,切片厚度为0.2μmm。切片完成后,经过脱蜡,复水等一系列步骤后对片子进行HE染色,染色完成后干燥封片,并用倒置荧光显微镜进行拍照。18.取三个月大不同基因型小鼠下颌固定,接着用显微-CT扫描并进行三维合成图片,比较不同基因型样本之间的差异。19.取三个月大不同基因型小鼠下颌固定,接着进行梯度脱水,然后浸泡在不同梯度的树脂中,最后包埋在树脂中进行打磨。将打磨好的样本喷金,然后通过扫描电子显微镜拍照,比较不同基因型样本之间的差异。20.取出生后3天C57BL/6小鼠的下颌,利用液氮研磨,TRIZOL提取组织RNA,逆转录为cDNA。比较不同基因型小鼠ssuh2基因的同源基因RNA水平表达量的不同,并比较与牙齿发育相关基因在不同基因型小鼠中的表达量。结果通过基于SNP的连锁分析技术以及微卫星精确定位,将致病基因的候选区域定位在3p26.1-3p24.3(chr3:6,732,117-18,359,306),结合目标区域捕获测序法筛查SNP及家系共分离确定致病基因ssuh2,通过Sanger测序发现ssuh2突变c.353CA(P118Q),通过体内实验发现,家系中患者外周血中的mRNA表达水平低于正常人。在体外细胞实验中发现,突变后的蛋白亚细胞定位并没有发生改变,但是mRNA表达水平和蛋白质的表达均低于正常水平。提取斑马鱼56hpf的总RNA,用逆转录好的cDNA做模板进行普通PCR,确定牙齿发育相关基因在此时间段表达,结果显示：Bmp2a, Pitx2,Pax9在斑马鱼胚胎发育早期有表达；为了确定它们在胚胎中的是否受ssuh2基因的影响,进行了这个发育时期的胚胎整体原位杂交实验,结果显示：Bmp2a,Pitx2,Pax9主要集中在斑马鱼腮弓处表达,ssuh2基因通过morpholino降低表达后,与牙齿发育相关基因Bmp2a,Pitx2,Pax9表达量均表现为降低的趋势。首先确定ssuh2在小鼠中的时空表达谱,发现ssuh2在小鼠体内广泛表达,在胚胎发育时期和牙齿发育时期表达随时间推移增高,但是在小鼠牙齿发育完成后表达降低。通过小鼠剪脚趾提取DNA后鉴定,确定基因缺陷小鼠的ssuh2基因发生突变,取出生后15天小鼠下颌提取RNA,比较不同基因型小鼠ssuh2基因的表达差异,结果显示：杂合子与纯合子小鼠ssuh2基因的表达量均比正常小鼠低,并且存在剂量效应；取一月龄不同基因型小鼠下颌,进行HE染色,结果显示：野生型小鼠有较宽的前牙本质区,杂合子小鼠的前牙本质区变窄,纯合子小鼠的前牙本质区基本消失；取三月龄不同基因型小鼠的下颌,经过显微CT扫描,三维合成后结果显示：杂合子和纯合子小鼠相比于野生型小鼠的牙髓腔都有相应的减小；取一月龄不同基因型小鼠的下颌,经过电子扫描显微镜观察,结果显示：野生型小鼠的牙本质小管排列紧密,杂合型小鼠的牙本质小管减少,纯合子小鼠的牙本质小管比杂合小鼠的牙本质小管更少。结论根据本课题组的研究,通过连锁分析技术以及微卫星定位,将致病基因的候选区域定位在3p26.1-3p24.3(chr3:6,732,117-18,359,306),结合目标区域捕获测序法筛查SNP及家系共分离确定致病基因ssuh2,通过Sanger测序发现ssuh2突变c.353CA(P118Q),通过体内实验发现,家系中患者外周血中的nRNA表达水平低于正常人。在体外细胞实验中发现,突变后的蛋白亚细胞定位并没有发生改变,但是mRNA表达水平和蛋白质的表达均低于正常水平。发现斑马鱼中ssuh2同源基因缺陷可以导致斑马鱼牙齿发育缺陷。通过morpholino降低斑马鱼中ssuh2同源基因的表达,运用整体原位杂交技术确定ssuh2斑马鱼同源基因的低表达会导致其它与牙齿发育相关基因的表达改变：Bmp2a, Pitx2, Pax9表达量在斑马鱼牙齿早期发育均表现为降低的趋势。利用普通PCR相对定量证实ssuh2在小鼠中的同源基因在小鼠胚胎发育期和出生后前期发育均有表达,且在胚胎发育期ssuh2随发育时间增加表达上升。在出生后7天表达量达到高峰,而成年小鼠几乎不表达；取出生后15天小鼠的各个器官,提取RNA,研究ssuh2基因在小鼠中的表达谱。ssuh2基因在小鼠的大部分器官中均表达,但在舌头,下颌,脑以及小肠表达量较高。通过knock-in技术构建ssuh2基因缺陷小鼠,提取出生后3天小鼠的下颌RNA,通过RT-RCR技术确定杂合子小鼠ssuh2基因的表达量比野生型小鼠ssuh2基因的表达量低,而纯合子小鼠ssuh2基因的表达量比杂合子ssuh2基因的表达量低,说明ssuh2基因存在剂量效应导致牙齿缺陷。通过Micro-CT和电子扫描显微镜技术对不同基因型小鼠下颌进行比较,发现ssuh2基因缺陷存在剂量效应,基因缺陷小鼠的牙齿比正常基因型小鼠牙齿的牙髓腔小,牙本质小管也减少。通过石蜡切片,HE染色,观察小鼠牙齿的病理形态,基因缺陷小鼠的前牙本质区减少。通过RT-PCR技术,确定小鼠ssuh2同源基因缺陷可以导致小鼠牙齿发育相关基因表达改变,包括DSPP, PAX9, Bmp2, Bmp4, Runx2, DMP1,由此可以看出基因缺陷小鼠牙齿存在缺陷,牙釉质发育异常,牙髓腔减小,牙本质小管减少,前牙本质区减少,这些缺陷与DD-Ⅰ病人表型相似。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.9

【共引文献】

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1 杜伟;陈放;解正高;;ABCB6基因在一常染色体显性遗传脉络膜缺损家系中的突变筛查(英文)[J];国际眼科杂志;2014年12期

2 赵牧;王宇;冯驰;;翼状胬肉cDNA文库的构建及序列分析[J];基础医学与临床;2013年12期

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 李端琢;ABCB6突变导致遗传性泛发型色素异常[D];华中科技大学;2013年

2 李端琢;ABCB6突变导致遗传性泛发型色素异常[D];华中科技大学;2013年

3 刘彦慧;两个遗传病家系的临床和分子病理学分析[D];南方医科大学;2012年

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1 王娜;泛发性色素异常症致病基因的分离与功能分析[D];济南大学;2013年

2 吴秋月;两种遗传性色素异常患者临床及分子遗传学研究[D];南京师范大学;2014年

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本文编号：1258630