P物质加载自固化磷酸钙复合材料诱导BMSCs分化的体外研究

发布时间：2017-12-06 23:28

  本文关键词：P物质加载自固化磷酸钙复合材料诱导BMSCs分化的体外研究

  更多相关文章： 自固化磷酸钙(CPC) P物质 胶原 骨髓间充质细胞(BMSCs)

【摘要】：目的:由炎症、创伤等各种原因导致的牙槽骨缺损、缺失在临床上十分常见,对患者口腔的功能和美观均可造成严重的影响,利用再生医学和组织工程理论与技术构建牙槽骨修复重建材料是解决这些问题的重要方向。自固化磷酸钙(CPC)也被称为骨水泥,是具有良好生物相容性的植骨替代材料,能够调拌为糊剂随意塑形并自行固化,具有一定机械力学强度和骨引导性能,适合于复杂外形骨缺损的填充,但CPC在体内的降解速度缓慢,没有诱导骨再生的生物活性,填充骨缺损后难以早期转化为骨组织,不能满足牙槽外科修复重建的临床要求。本研究探索通过加载人工合成神经多肽P物质(SP)于CPC材料,并复合I型胶原,制备以磷酸钙为基础的复合材料支架,通过体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察材料诱导BMSCs增殖分化的作用,为进一步构建适用于复杂牙槽骨缺损修复的自固化组织工程材料提供基础实验依据。方法:1、材料准备:购买临床用自固化磷酸钙材料,人工多肽合成仪合成P物质,鼠尾腱提取3%I型胶原溶液,分为3组制备复合材料支架。A组为纯CPC组;B组为CPC+I型胶原组;C组为CPC+I型胶原+P物质组。采用扫描电子显微镜(SEM)观察支架样本表面形貌。2、SD大鼠BMSCs培养和鉴定:4周龄雌性大鼠,经深度麻醉后脱颈处死,解剖股骨及胫骨,去净软组织后切除干骺端,PBS缓冲液冲出骨髓,经离心后转移至培养瓶内,加入α-DMEM细胞培养基(含10%胎牛血清),CO2细胞培养箱内培养。隔天PBS冲洗并更换新鲜培养基继续培养,之后每2天换液1次。通过测定细胞增殖对数、成骨及成脂诱导对BMSCs进行鉴定。3、P物质对BMSCs生物学行为的影响:原代BMSCs经传代培养至P4代,接种于96孔板,随机分为2组,实验组培养液加入P物质,分别测定1,3,5,6,7天细胞增殖对数,并绘图比较两组差异。4、各组材料对BMSCs生物学行为的影响:原代BMSCs经传代培养至P4代,分别接种于各组材料表面,SEM观察BMSCs的形态、粘附与增殖,荧光染色定量分析BMSCs的粘附与增殖,ALP试剂盒检测细胞ALP活性,茜素红染色钙沉积物,比较BMSCs的成骨分化。结果:1、材料合成:A、B、C三组材料在SEM下观察表面形貌,可见A组材料表面大量纳米级磷灰石结晶结构,孔隙直径一般为50微米以下;B、C两组材料可见胶原与CPC联结紧密,被覆于磷灰石结晶表面,材料孔隙较大,条索状,可达50微米以上。2、SD大鼠BMSCs培养和鉴定:原代BMSCs生长旺盛,生长曲线复合典型“S”形,培养3天约占瓶底50%,5天约占瓶底70%,7天即可传代培养。分别经成骨和成脂诱导液培养3周,行茜素红和油红O染色,光学倒置显微镜下分别可见钙化结节及脂滴形成,BMSCs多向分化能力良好。3、P物质对BMSCs生物学行为的影响:96孔板内细胞经测定1,3,5,6,7天的BMSCs增殖对数,实验组(加入P物质)BMSCs增殖显著优于对照组(P0.05)。4、各组材料对BMSCs生物学行为的影响:SEM下观察,A组表面BMSCs粘附数量少于B、C组,A组表面BMSCs细胞多呈梭形,细胞突触较短;B、C组表面BMSCs细胞呈不规则多边形、星型,特别在胶原表面细胞数量多,突触长并彼此相联,细胞伸展良好。荧光染色后,经荧光显微镜下观察,A、B、C三组材料表面1,7,14天BMSCs活细胞数量逐渐增加,14天时已基本铺满,死或凋亡细胞比例逐渐减少,C组活细胞比例略高于A、B两组。成骨诱导14天后茜素红染色,肉眼观C组颜色较深,ALP检测C组BMSCs的ALP表达高于A、B两组。结论:CPC复合胶原成分并加载P物质制备的复合材料支架,对大鼠BMSCs的粘附、增殖均具有促进作用,BMSCs的成骨分化、ALP表达等显著提高,无细胞毒性,是一种具有良好应用前景的自固化骨再生诱导组织工程材料。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782
，

本文编号：1260360