DUSP1在涎腺腺样囊性癌中的作用及相关机制研究

发布时间：2017-12-14 15:17

  本文关键词：DUSP1在涎腺腺样囊性癌中的作用及相关机制研究

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【摘要】：目的涎腺腺样囊性癌(SACC)是较常见的涎腺恶性肿瘤,具有嗜神经侵袭并顺其逐渐扩散转移的生物学特性,进而导致SACC患者术后的转移率、复发率均较高,预后不佳,然而目前对SACC高侵袭性及转移的机制仍缺乏认识。双特异性磷酸酶1(DUSP1),是一种双向特异性苏/酪氨酸磷酸酯酶,其可通过脱磷酸来调节MAPK信号通路的活性,进而在细胞生长周期及细胞增殖等方面起到极其重要的调控作用。近年来表观遗传学在肿瘤研究中日益受到重视,DNA甲基化是恶性肿瘤常见的生物学现象,甲基化为转录水平调控,可通过抑制甲基化基因nRNA的产生而使蛋白生成减少。目前在SACC中已有抑癌基因异常甲基化的相关报道,但DUSP1在SACC中的表达及甲基化状态仍未见报道。方法1.采用免疫组化法检测48例SACC石蜡组织和20例癌旁石蜡组织中DUSP1表达水平,并收集临床资料,分析DUSP1与SACC患者临床病理特征的关系。2.采用RT-PCR法检测32对SACC和癌旁冰冻组织中DUSP1的RNA水平。3.采用Kaplan-Meier法、Cox回归分析法,检验DUSP1表达情况与患者预后的关系。4.实时定量甲基化特异性PCR(qMSP)法检测SACC癌细胞及对应癌旁细胞中DUSP1基因启动子区域的甲基化状态,并运用不同浓度5-Aza-dc处理涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83和SACC-LM,采用western blot检测5-Aza-dc处理后DUSP1基因蛋白表达的改变情况。5.运用慢病毒转染技术,建立DUSP1过表达细胞株(SACC-83-DUSP1, SACC-LM-DUSP1)和阴性对照细胞株(SACC-83-vector, SACC-LM-vector)。6.运用克隆形成实验、Transwell Insert细胞侵袭实验、体外划痕愈合实验和MTT细胞增殖实验,来测定DUSP1表达上调对涎腺腺样囊性癌细胞的增殖、侵袭及迁移等的影响。7.采用人全基因组芯片测序法,检测SACC-83-DUSP1和SACC-83-vector两细胞株下游调控通路的不同。8.采用裸鼠成瘤试验,检测DUSP1表达上调对裸鼠涎腺腺样囊性癌成瘤及转移等的影响。结果1.免疫组化结果示：DUSP1在20例癌旁组织中均呈阳性表达,表达阳性率100%;48例SACC组织中,18例阳性表达,表达阳性率为37.5%,将两组表达阳性率比较,差异有统计学意义(P0.05)。不同T分期、淋巴结转移、神经侵犯、局部侵犯患者的DUSP1的表达量的差异有统计学意义(均P0.05),而不同性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型、远处转移患者的DUSP1的表达量的差异均无统计学意义(均P0.05)。2. RT-PCR结果示：SACC组织中DUSP1的表达量显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(P0.05)。3.单因素生存曲线比较(Kaplan-Meier 法)显示：30例DUSP1阴性表达患者中,发生肿瘤复发者为21例(70%),18例DUSP1日性表达患者中,发生肿瘤复发者为4例(22.2%),差异有统计学意义(P=0.028),但多因素生存分析(Cox回归分析)显示DUSP1表达仍不是患者预后的独立指标。4.实时定量甲基化特异性PCR (qMSP)法检测发现,SACC癌细胞DUSP1基因启动子甲基化程度明显比对应癌旁细胞高,且运用western blot检测发现,经5-Aza-dc处理后,SACC-83和SACC-LM细胞中DUSP1蛋白的表达水平显著提高。5. DUSP1过表达慢病毒转染SACC-83、SACC-LM细胞后,发现两细胞株的DUSP1蛋白表达水平均明显上调,成功建立了DUSP1过表达细胞株(SACC-83-DUSP1, SACC-LM-DUSP1)和阴性对照细胞株(SACC-83-vector, SACC-LM-vector)。6.克隆形成实验、Transwell Insert细胞侵袭实验、体外划痕愈合实验和MTT细胞增殖实验结果示：DUSP1过表达的细胞株(SACC-83-DUSP1, SACC-LM-DUSP1)的克隆形成能力、侵袭力、迁移能力和细胞增殖能力均弱于阴性对照细胞株(SACC-83-vector, SACC-LM-vector)。7.全基因组芯片数据发现：在GO功能富集分析中,过表达DUSP1后SACC-83细胞中差异表达基因主要富集于olfactory transduction, metabolic pathways以及neuroactive ligand-receptor interaction等重要过程；KEGG通路富集分析结果提示过表达DUSP1影响到cytoskeleton、positive regulation of gene expression和integrin-mediated signaling pathway等多条信号通路的激活。8.裸鼠成瘤试验结果示：SACC-83-DUSP1组10只裸鼠中3只成瘤、但均未发生转移；SACC-83-Vector组10只裸鼠中10只裸鼠均成瘤,且发生转移。结论DUSP1在SACC中表达明显低于癌旁组织,DUSP1低表达与T分期、淋巴结转移、神经侵犯、局部侵犯和肿瘤复发相关；SACC组织中发现DUSP1基因启动子存在高水平甲基化,且SACC中DUSP1表达水平与DUSP1启动子甲基化呈明显负相关；DUSP1表达上调可使SACC细胞的克隆形成能力、侵袭力、划痕愈合能力和细胞增殖能力,以及裸鼠成瘤及转移能力明显减弱,且与多条信号调控通路密切相关。以上结果说明DUSP1在SACC中起到了一个抑癌基因的角色,DUSP1表达上调可明显抑制SACC的发生发展,有望成为SACC预后评价、临床诊断及治疗的有效生物标记物。
【学位授予单位】：浙江中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.8

【参考文献】

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1 王佳峰;葛明华;王可敬;谭卓;陈超;徐加杰;;小涎腺腺样囊性癌52例临床分析[J];中华口腔医学杂志;2012年12期

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本文编号：1288371