硝酸盐转运蛋白Sialin在人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型的初步探究

发布时间：2017-12-15 20:31

  本文关键词：硝酸盐转运蛋白Sialin在人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型的初步探究

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【摘要】：目的:建立血管内皮细胞缺氧复氧模型,模拟血管缺血再灌注损伤过程,研究硝酸盐转运蛋白Sialin在组织缺血再灌注损伤中的表达变化,初步研究缺氧复氧损伤与Sialin的相关性,并初步探讨硝酸盐对细胞的作用,为临床上预防和治疗组织瓣缺血再灌注损伤提供新思路。材料和方法:第一部分:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧复氧模型,模拟血管缺血再灌注损伤过程。将HUVEC根据不同缺氧时间分为四组:正常对照组(Control组);缺氧3h/复氧2h组(3h/2h组);缺氧6h/复氧2h组(6h/2h组);缺氧9h/复氧2h组(9h/2h组)。细胞缺氧过程中换用低糖DMEM无血清培养基,使用厌氧细胞培养盒进行细胞缺氧培养,完成后换用原培养基,镜下观察细胞形态、数目,CCK-8测定细胞活性,Annexin V-PI染色法流式细胞仪检测细胞凋亡比例。评价人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型的有效性。第二部分:Sialin在HUVEC缺氧复氧模型中表达变化的研究。RT-PCR、Western Blot、免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察Sialin在HUVEC细胞上的表达及定位;Real-time PCR及Western Blot分别检测Sialin基因及蛋白的表达水平变化;第三部分:硝酸盐对血管内皮细胞缺氧复氧损伤的初步探究。细胞外加载30mmol/L硝酸钠,镜下观察细胞形态学变化、细胞活性及细胞凋亡情况,初步探讨硝酸盐对细胞缺氧复氧损伤的作用。结果:1.HUVEC缺氧复氧模型实验,显微镜下观察:随缺氧时间增加,死细胞数量增加,细胞密度明显减低;台盼蓝实验:活细胞比例随缺氧时间增加明显下降(P0.05);CCK-8实验:各实验组随缺氧时间增加细胞活性明显降低(P0.05);细胞凋亡实验:随缺氧时间增加,细胞早期凋亡、晚期凋亡比例均明显上升(P0.05),活细胞比例显著下降(P0.05)。结果证明,各组细胞缺氧复氧损伤程度加重。RT-PCR、Western Blot实验及细胞免疫荧光实验证明了Sialin蛋白在HUVEC细胞膜上及胞质内有较高水平表达;Real-time PCR、Western Blot实验证明HUVEC中Sialin表达水平随缺氧时间增加而显著下降(P0.05)。2.细胞凋亡实验及CCK-8实验,证明常氧及缺氧复氧条件下,细胞外加载浓度为30 mmol/L的硝酸钠,细胞活性较对照组均明显降低(P0.05),且早期凋亡和晚期凋亡比例较Control组明显上升(P0.05),正常细胞比例明显下降(P0.05);而在缺氧复氧条件下,细胞外加载硝酸钠,CCK-8的OD变化值及凋亡实验中正常细胞比例的变化值均较常氧条件下明显降低(P0.05);此外,镜下形态学观察,发现加载硝酸盐组细胞在缺氧3h后即刻,形态发生明显变化,呈长梭形,有管腔样结构形成,复氧后,形态恢复。结论:1.使用人脐静脉内皮细胞,建立了血管内皮细胞的缺氧复氧损伤模型;随着缺氧时间延长,细胞活力降低,细胞凋亡增加;2.证明了Sialin在HUVEC细胞膜及细胞质上有较高表达,且随缺氧损伤加重,Sialin表达水平下降;3.常氧条件下,细胞外加载高浓度硝酸盐,有明显的细胞毒性作用;缺氧复氧条件下,细胞外加载高浓度硝酸盐,细胞毒性作用明显下降,提示缺氧后硝酸盐对细胞作用可能发生改变。
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782

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1 牛其芳;硝酸盐转运蛋白Sialin在人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型的初步探究[D];首都医科大学;2016年

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本文编号：1293374