不同fimA型牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人脐动脉平滑肌细胞功能的影响

发布时间：2017-12-19 09:40

  本文关键词：不同fimA型牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人脐动脉平滑肌细胞功能的影响

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【摘要】：目的:分析比较Ⅰ、Ⅳfim A型牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.gingivalis-LPS)对人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs)的增殖、迁移能力和表型转化的影响,探讨不同fim A型P.gingivalis-LPS感染在动脉粥样硬化(As)发生发展过程中的可能作用。方法:1.厌氧条件下培养Ⅰfim A型P.gingivalis(ATCC33277)和IVfim A型P.gingivalis(W83)。2.采用热酚-水法提取P.gingivalis-LPS,并通过鲎试验、SDS-PAGE对所提取的脂多糖进行鉴定。3.体外培养的HUASMCs 5~6代,加入96孔培养板,采用CCK-8检测不同终浓度的P.gingivalis-LPS(0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)在2h、8h、24h、48h对平滑肌细胞增殖的影响,酶标仪450nm处测定各组OD值。4.后续实验采用终浓度为10μg/ml的P.gingivalis-LPS,与HUASMCs共培养2h、8h、24h、48h后,采用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验检测HUASMCs的迁移情况,透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞术检测收缩型标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(α-SM-actin)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM-MHC)和合成型标志细胞视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol bindingprotein-1,CRBP-1)的表达变化情况。结果:1.I、IV fim A型P.gingivalis-LPS对HUASMCs的增殖作用具有时间、浓度依赖性,随着刺激时间的延长、刺激浓度的增加,HUASMCs的增殖越强(P0.05);在同一刺激浓度和作用时间点,IV fim A型P.gingivalis-LPS刺激HUASMCs的增殖作用强于I fim A型P.gingivalis-LPS(P0.05)。2.划痕实验中,2h,8h,24h,48h时,I、IV fim A型P.gingivalis-LPS均能促进HUASMCs迁移,随着刺激时间的延长,HUASMCs迁移距离增加,至观察末期(48h)表达量达到峰值,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。在24h,48h时,IV fim A型P.gingivalis-LPS组HUASMCs迁移距离高于I fim A型P.gingivalis-LPS组,差异具有统计学意义(P0.05)。Transwell实验结果与划痕实验结果相近,但仅在48h时,IV fim A型P.gingivalis-LPS组HUASMCs迁移细胞数目高于I fim A型P.gingivalis-LPS组,差异具有统计学意义(P0.05)。3.通过电镜观察,在2h、8h、24h、48h时,I、IV fim A型P.gingivalis-LPS刺激后HUASMCs由收缩型逐渐转换为合成型表型,细胞体积较大,胞质内见大量线粒体、粗面内质网,高尔基体等细胞器增多,糖原等物质合成增多,肌丝成分较少,且吞噬体增多。在2h、8h、24h、48h时,IV fim A型P.gingivalis-LPS刺激的HUASMCs均可见脂滴出现和增多。I fim A型P.gingivalis-LPS刺激的HUASMCs未见脂滴的出现,至观察末期48h,可见粗面内质网不同程度水肿。4.I、IV fim A型P.gingivalis-LPS刺激后,上调HUASMCs的合成型标志分子CRBP-1的表达,下调HUASMCs收缩型标志分子ɑ-SMA、SM-MHC的表达,IV fim A型P.gingivalis-LPS上调CRBP-1表达的作用强于I fim A型P.gingivalis-LPS(P0.05);在48h IVfim A型P.gingivalis-LPS下调ɑ-SMA表达作用强于I fim A型P.gingivalis-LPS(P0.05);在24h IVfim A型P.gingivalis-LPS下调SM-MHC表达的作用强于Ifim A型P.gingivalis-LPS(P0.05)。结论:I、IV fim A型P.gingivalis-LPS的刺激可导致平滑肌细胞的表型由收缩型转换为更加活跃的合成型、并促进平滑肌细胞的增殖和迁移,从而可能参与和影响As的发生、发展;不同fim A型P.gingivalis-LPS对平滑肌细胞的促增殖、迁移和表型转换作用存在一定的差异。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R780.2

【参考文献】

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本文编号：1307761