变形链球菌耐氟菌株耐酸相关dnaK操纵子结构基因突变的检测

发布时间：2017-12-26 19:19

本文关键词：变形链球菌耐氟菌株耐酸相关dnaK操纵子结构基因突变的检测　出处：《吉林大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：基因组学(genomics)是在分子生物学技术、电子计算机技术和信息网络技术等研究手段的辅助下，研究生物体内所有基因，在整体水平上探索生命活动的内在规律及其内外环境影响机制的科学。它对所有基因进行基因组作图、核苷酸序列分析、基因定位和功能分析。基因组学对口腔医学发展的推动作用主要体现在对口腔致病微生物的基因组学研究[1]。龋病是以细菌为主的多因素作用下，导致牙无机物脱矿、有机物分解的牙体硬组织慢性进行性破坏的一种疾病，也是口腔常见疾病之一，并被世界卫生组织列为危害人类的三大疾病之一。龋病也被称为牙体硬组织的细菌感染性疾病，而变形链球菌是致龋能力最强的龋病致病菌[2-4]。变形链球菌的致龋性主要取决于其产酸性和耐酸性[5]。目前氟化物广泛应用于临床防龋治疗，而长期大量使用氟化物防龋可能会出现耐氟菌株。而研究证实变形链球菌耐氟菌株比亲代菌株有更强的致龋能力。目前学者仅限于对变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因ffh、dfp、dltC、dnaK[6-8]等进行了基因突变检测，而对于耐酸相关操纵子的突变情况还不清楚，仍需进一步研究。目前变形链球菌（UA159）全基因组及变形链球菌耐氟菌株（UA159-FR）全基因组测序已经完成，可直接从网上获得，，其GenBank登录号AE014133[9]，CP007016[10]。本实验组已经成功在体外诱导出变形链球菌耐氟菌株[11]。变形链球菌dnaK操纵子由hrcA-grpE-dnaK-dnaJ组成。本实验在分子水平上对耐氟菌株耐酸相关操纵子dnaK操纵子进行结构基因突变检测，应用PCR直接测序技术[12]，确定dnaK操纵子结构基因是否发生突变。本实验为更进一步了解变形链球菌耐氟菌株的致龋毒力机制打下基础。这也为今后临床更合理的应用氟化物防龋，以及应用分子生物学方法对致龋菌进行基因重组，改变遗传性状奠定了理论及实验基础。方法： 1.体外诱导变形链球菌耐氟菌株UA159-FR，变形链球菌耐氟菌株UA159-FR的筛选与鉴定。 2.变形链球菌耐氟菌株基因组的提取。 3.根据GenBank发表的变形链球菌dnaK操纵子结构基因序列，及引物设计的原则，设计、合成引物。以变形链球菌耐氟菌株UA159-FR基因为模板进行PCR反应，获取扩增的目的基因片段。利用PCR产物纯化试剂盒回收纯化PCR产物，交由生化公司进行测序。 4.应用NCBI BLAST核酸序列比对工具，将变形链球菌耐氟菌株UA159-FR的dnaK操纵子测序结果与亲代菌株变形链球菌UA159的dnaK操纵子结构基因序列进行比对。结果： 1.实验培养的细菌鉴定为变形链球菌耐氟菌株UA159-FR。 2.完成了变形链球菌耐氟菌株UA159-FR dnaK操纵子结构基因的测序。 3.将变形链球菌耐氟菌株UA159-FR dnaK操纵子的结构基因与变形链球菌UA159通过blast比对，发现dnaK操纵子的结构基因序列改变。hrcA-grpE基因片段突变位点为943（T缺失），dnaK-dnaJ基因片段突变位点为2128（A插入），2298（C缺失）。结论：成功完成了变形链球菌耐氟菌株UA159-FR dnaK操纵子基因测序，发现dnaK操纵子的结构基因序列发生突变，证实变形链球菌耐氟菌株的耐酸性增强与dnaK操纵子结构基因的改变有关，hrcA-grpE基因片段突变位点为943（T缺失），dnaK-dnaJ基因片段突变位点为2128（A插入），2298（C缺失）。为进一步研究变形链球菌耐氟菌株致龋毒力奠定理论基础。同时推测变形链球菌耐氟菌株致龋性增强可能还与操纵子的耐酸调控机制以及操纵子与突变基因之间的转录调控作用有一定关系。这为今后临床更合理的应用氟化物防龋，以及龋病预防药物的研发提供一定的理论及实验基础。
[Abstract]:Objective:
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R780.2

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