高压氧促进炎性髁突软骨细胞外基质表达作用的研究

发布时间：2018-01-01 00:00

  本文关键词：高压氧促进炎性髁突软骨细胞外基质表达作用的研究　出处：《山东大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：探讨高压氧调节P13K/AKT信号通路促进炎性髁突软骨细胞表达细胞外基质的作用。方法：体外培养3-4周SD大鼠髁突软骨细胞。在无菌环境下,取双侧髁突,以含有双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)冲刷并剥离软骨,反复剪切至1mm3大小,首先在37℃环境下用0.25%浓度的胰蛋白酶消化30分钟,然后37℃振荡加入浓度为0.2%的Ⅱ型胶原酶,1-2小时消化完后、分离原代软骨细胞并培养,通过倒置显微镜每天观测原代软骨细胞生长、形态变化,并用细胞形态学、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定培养结果。随机将第2代处于对数生长期髁突软骨细胞分为四组,分别用0、0.1、1、10ng/ml IL-1β处理24小时,对各组之间Ⅱ型胶原、AGG蛋白和ⅠnRNA表达量进行检测,并筛选出能造成髁突软骨细胞炎性状态的IL-1β最佳浓度；取第2代处于对数生长期髁突软骨细胞随机分为四组：对照组,细胞不做任何处理；IL-1β组,lOng/ml IL-1β处理24小时；HBO组,lOng/ml IL-1β处理24小时后HBO每天处理90分钟,共四天。Inhibitor+HBO 组:10ng/ml IL-1β处理24小时,提前一小时加入25uMLY294002(PI3K抑制剂)后HBO每天处理90分钟,共四天。分别用CCK-8法检测各组细胞增殖活性；western blotting、免疫组化或者免疫荧光检测各组之间collagen Ⅱ、AGG、PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT的蛋白表达量；qRT-PCR检测各组collagen Ⅱ、AGG、PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT mRNA表达量。结果：(1)消化髁突,提取软骨细胞接种,观察见细胞呈形态规则、小球形。一天后,多数细胞贴附于培养瓶底,镜下观察可呈多角形；5天后,可观察到“铺路石”样外观,培养瓶底面被80%左右的细胞铺满。经一次传代后,细胞贴壁速度明显加快,匀称分布,当细胞长满,再次传代；据我们观察在3代以内,软骨细胞增殖速率快,在此以后,髁突软骨细胞呈长梭形,出现“去极化”现象,生长速度明显变缓。胞浆内可见有棕黄色颗粒和红色荧光颗粒经Ⅱ型胶原免疫细胞化学和细胞免疫荧光染色。(2) 10ng/ml IL-1β降低髁突软骨细胞Ⅱ型胶原和AGG表达的效果最明显。(3)高压氧干预炎性髁突软骨细胞后,细胞增殖活性明显增高,collagen Ⅱ、AGG, p-PI3K 和 p-Akt表达水平明显升高；高压氧干预并加入PI3K抑制剂后,髁突软骨细胞增殖活性降低,collagen Ⅱ、AGG、p-PI3K和p-Akt表达水平下降。结论：高压氧通过PI3K/Akt通路促进炎性髁突软骨细胞表达细胞外基质、升高软骨细胞的增殖活性,为临床治疗TMJ-OA提供新方式。
[Abstract]:Objective: to investigate the role of hyperbaric oxygen in regulating P13K / AKT signaling pathway to promote the expression of extracellular matrix in inflammatory condylar chondrocytes. Condylar chondrocytes of SD rats were cultured in vitro for 3-4 weeks. The condyle of both sides was taken and washed with phosphate buffer solution (PBS) containing double antibodies. The cartilage was repeatedly cut to the size of 1mm3. At 37 鈩，

本文编号：1362016